銀屑病表皮角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙的機制與功能研究.pdf

1、[研究背景]
　　 銀屑病是一種常見的多基因遺傳、多環(huán)境因素誘導的慢性炎癥性增殖性皮膚病。目前認為銀屑病不僅僅只是一種皮膚疾病，因為銀屑病患者往往伴有糖尿病、高血壓、冠心病、肥胖、抑郁和代謝綜合征等系統(tǒng)性疾病，所以，銀屑病現(xiàn)已成為嚴重影響廣大人民群眾身心健康的復雜性疾病之一。
　　 眾所周知，外用糖皮質(zhì)激素制劑在治療銀屑病中應用最廣泛，是銀屑病治療的一線藥物，其對銀屑病皮損的清除十分迅速有效。糖皮質(zhì)激素(Glucocor

2、ticoid，GC)的作用如此強大，主要是通過其受體--糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoidreceptor，GR)來實現(xiàn)的。GR屬于核受體家族，廣泛分布于幾乎所有細胞上。
　　 大量研究表明GR能夠在細胞核和細胞漿之間穿梭。在沒有激素的情況下，GR主要存在于細胞胞漿中，與分子伴侶和其他蛋白組成多蛋白復合物。GC與GR結(jié)合后誘導多蛋白復合物發(fā)生構(gòu)象變化，促使GR從復合物中解離，并轉(zhuǎn)位至細胞核中。根據(jù)細胞類型的不同，未轉(zhuǎn)化

3、的GR可以位于胞漿或胞核中。一旦與配體結(jié)合，未轉(zhuǎn)化的GR即通過核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位進入細胞核，細胞核中GR與特異性DNA序列糖皮質(zhì)激素反應元件結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 我們的初步研究表明，正常人角質(zhì)形成細胞中GR位于細胞核中，而銀屑病角質(zhì)形成細胞中GR則位于細胞漿中，即銀屑病角質(zhì)形成細胞中GR發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙。哪些因素導致了GR核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙的發(fā)生?GR核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙的機制和意義是什么?這些問題促使我們通過體外細胞培養(yǎng)和建立銀屑病小

4、鼠模型對銀屑病皮損角質(zhì)形成細胞中GR的表達和功能進行深入的綜合分析，探討GR在銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中的變化及其在表皮角質(zhì)形成細胞增殖過程中的作用。
　　 [目的]
　　 明確在銀屑病角質(zhì)形成細胞中，存在糖皮質(zhì)激素受體的核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙；闡明銀屑病角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙的原因以及可能的信號傳導通路的作用；明確導致銀屑病角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙的機制，發(fā)現(xiàn)新的與糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)的分子及其作用

5、；闡明銀屑病角質(zhì)形成細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙的意義，從而通過促進糖皮質(zhì)激素受體的核轉(zhuǎn)位，發(fā)現(xiàn)治療銀屑病的新方法。
　　 [方法]
　　 第一部分：間接免疫熒光法檢測糖皮質(zhì)激素受體在正常表皮和銀屑病皮損的表達和定位；分離和培養(yǎng)正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細胞，以間接免疫熒光法檢測糖皮質(zhì)激素受體在細胞中的定位；以WesternBlot法比較糖皮質(zhì)激素受體在正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細胞中表達；ELISA法檢測銀屑病患者外周血中

6、促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇的水平；將細胞因子(如VEGF16s和IFN-γ等)與體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞共孵育，間接免疫熒光法檢測對糖皮質(zhì)激素受體的核質(zhì)分布影響。
　　 第二部分：分離和培養(yǎng)正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細胞，與GSK-3、p53和微管蛋白抑制劑共培養(yǎng)，間接免疫熒光法檢測上述因素對糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)位的影響；以外源性細胞因子刺激培養(yǎng)的正常人和銀屑病角質(zhì)形成細胞，間接免疫熒光法檢測對糖皮質(zhì)激素受體的影響。
　　

7、 第三部分：外用咪喹莫特誘導Balb/c小鼠產(chǎn)生銀屑病樣皮損；靜脈注射IL-13和微管抑制劑vincristine，觀察對咪喹莫特誘導銀屑病樣皮損的影響；對小鼠標本進行Masson三染，評價IL-13和vincristine對咪喹莫特誘導小鼠的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 一、糖皮質(zhì)激素受體在銀屑病表皮和正常表皮的定位和定量表達：
　　 1.糖皮質(zhì)激素受體強烈表達于銀屑病表皮和正常表皮除角質(zhì)層外的各層細胞；

8、>　　 2.糖皮質(zhì)激素受體在銀屑病表皮和正常表皮細胞內(nèi)的分布是不同的：糖皮質(zhì)激素受體位于銀屑病表皮細胞的胞漿中，而在正常表皮細胞中卻位于胞核內(nèi)；
　　 3.體外培養(yǎng)的銀屑病和正常角質(zhì)形成細胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的分布與組織免疫熒光結(jié)果一致：糖皮質(zhì)激素受體位于銀屑病角質(zhì)形成細胞的胞漿中，而位于正常角質(zhì)形成細胞的胞核內(nèi)；
　　 4.銀屑病與正常角質(zhì)形成細胞之間糖皮質(zhì)激素受體的表達量無差異；
　　 二、銀屑病與正常角質(zhì)形

9、成細胞糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運影響因素：
　　 1.銀屑病患者與正常對照之間外周血促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇水平無差異；
　　 2.VEGF165和IFN-γ可誘導正常角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運障礙；
　　 3.地塞米松可逆轉(zhuǎn)VEGF165和IFN-γ誘導的糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運障礙；
　　 4.內(nèi)皮素-1、肝細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、白介素10、白介素13、白介素17、血小板源性生長因子AA/AB/BB

10、對正常角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運無影響；
　　 5.ATP水平對正常角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體的核質(zhì)轉(zhuǎn)運無影響。
　　 三、銀屑病角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙機制：
　　 1.p53抑制劑可抑制VEGF165和IFN-γ誘導的糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙；
　　 2.微管抑制劑vincristine可抑制糖皮質(zhì)激素受體的核攝??；
　　 3.GSK-3抑制劑不能抑制糖皮質(zhì)激素受體的核

11、攝取；
　　 4.地塞米松促進銀屑病表皮角質(zhì)形成細胞胞漿糖皮質(zhì)激素受體進入細胞核內(nèi)；
　　 5.IL-13，PDGF-AA、PDGF-AB和PDGF-BB可促進銀屑病表皮角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體進入細胞核內(nèi)，而ET-1、HGF，TGF-β1、IL-10和IL-17不能促進糖皮質(zhì)激素受體進入細胞核內(nèi)；
　　 6.突然撤去地塞米松可誘導正常角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體聚集在胞漿中。
　　 四、IL-13和微管

12、抑制劑對瞇喹莫特誘導的小鼠銀屑病模型的影響：
　　 1.咪喹莫特誘導的Balb/c小鼠模型具有銀屑病的主要特征，包括表皮過度增殖肥厚、炎癥細胞浸潤和真皮微血管增生；
　　 2.IL-13可減輕咪喹莫特誘導小鼠的紅斑、鱗屑、表皮厚度和浸潤炎癥細胞的數(shù)目；
　　 3.微管抑制劑可加重咪喹莫特誘導小鼠的紅斑、鱗屑和微血管數(shù)目。
　　 [結(jié)論]
　　 一、銀屑病角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體發(fā)生了核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙

13、；
　　 二、銀屑病角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體發(fā)生的核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙與體內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇水平無關(guān)；
　　 三、VEGF165和IFN-γ可誘導正常角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙，而地塞米松可逆轉(zhuǎn)此誘導效應；
　　 四、角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙是非APT依賴的；
　　 五、VEGF165和IFN-γ誘導的糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙需要p53參與；
　　 六、微管介

14、導糖皮質(zhì)激素受體的核攝取，p53介導糖皮質(zhì)激素受體的核輸出，而GSK-3抑制劑不能抑制糖皮質(zhì)激素受體的核轉(zhuǎn)運；
　　 七、地塞米松促進銀屑病角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運需要微管參與；
　　 八、IL-13、PDGF-AA、PDGF-AB和PDGF-BB可促進銀屑病表皮角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體進入細胞核內(nèi)；
　　 九、突然撤去地塞米松可誘導正常角質(zhì)形成細胞糖皮質(zhì)激素受體聚集于胞漿；
　　 十、IL-1