一種基于公共引物介導(dǎo)的白血病分子診斷技術(shù)研究.pdf

1、目的：
　　本課題利用公共引物介導(dǎo)的多重RT-PCR技術(shù)，以常見(jiàn)的白血病融合基因作為檢測(cè)靶標(biāo)，目的在于研究建立新型的、系統(tǒng)的、提高PCR檢測(cè)通量的方法體系，研發(fā)適用于臨床的常見(jiàn)白血病融合基因檢測(cè)試劑盒。
　　方法：
　　本課題包括設(shè)計(jì)公共引物的設(shè)計(jì)與鑒定、重疊延伸法構(gòu)建質(zhì)粒模板、多重檢測(cè)體系的建立和臨床樣本檢測(cè)。
　?。?）用Primer Premier5.0軟件以非人基因組為模板進(jìn)行基礎(chǔ)公共引物的設(shè)計(jì)；采用NC

2、BI網(wǎng)站Primer-blast功能進(jìn)行公共引物與人基因組、人cDNA的特異性的理論比對(duì)；理論設(shè)計(jì)和篩選的公共引物分別與人基因組和人cDNA進(jìn)行特異性溫度梯度PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；將實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后的公共引物序列連接到人類(lèi)一段GAPDH基因的兩端，插入到載體中構(gòu)建質(zhì)粒，利用含公共引物的質(zhì)粒模板檢測(cè)公共引物擴(kuò)增的敏感性；
　?。?）文獻(xiàn)檢索和數(shù)據(jù)庫(kù)篩選本課題多重體系的白血病融合基因檢測(cè)靶標(biāo)；通過(guò)重疊延伸法將位于人cDNA上不同位置的兩個(gè)基因片段

3、通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得后連接在一起，插入載體構(gòu)建包含檢測(cè)靶標(biāo)融合基因的突變型質(zhì)粒模板：BCR/ABL e1a2型和e13a2型、PML/RARαL型和S型、E2A/PBX1 I型、AML1/ETO、E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL和CBFβ/MYH11 A型，另有一包含SIL/TAL1型融合基因的質(zhì)粒模板通過(guò)直接合成法獲得；
　　（3）利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)檢測(cè)靶標(biāo)基因特異性引物，將公共引物連接

4、在靶標(biāo)特異引物的5’末端構(gòu)成嵌合引物，利用NCBI網(wǎng)站Primer-blast功能進(jìn)行嵌合引物的比對(duì)、修改和篩選，同時(shí)利用MFE2.0軟件進(jìn)行體系多重引物的比對(duì)和修改；本課題針對(duì)常見(jiàn)的白血病融合基因設(shè)計(jì)了2個(gè)多重檢測(cè)體系，體系1針對(duì)BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和E2A/PBX1融合基因型；體系2在體系1基礎(chǔ)上添加檢測(cè)靶標(biāo)E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL、CBFβ/MYH11和SIL/TAL1；通過(guò)構(gòu)

5、建的包含白血病融合基因的突變型質(zhì)粒模板進(jìn)行體系特異性和敏感性檢測(cè)。將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，進(jìn)行多重體系的構(gòu)建和優(yōu)化；
　　（4）收集正常人及白血病患者的外周血，根據(jù)TRIzol一步抽提法獲得人total RNA，6隨機(jī)引物和MMLV逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果：本課題成功建立了篩選公共引物的方法體系；設(shè)計(jì)了三對(duì)公共引物，通過(guò)與人基因組、人cDNA的理論和PCR實(shí)驗(yàn)比對(duì)，結(jié)果均無(wú)產(chǎn)物；其中一對(duì)公共引物

6、與包含公共引物序列的質(zhì)粒載體進(jìn)行敏感性PCR檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果可達(dá)100個(gè)拷貝，選取該公共引物用于課題后期構(gòu)建多重檢測(cè)體系。采用重疊延伸技術(shù)成功構(gòu)建了十個(gè)包含白血病融合基因的突變型質(zhì)粒模板；本課題設(shè)計(jì)的兩個(gè)針對(duì)常見(jiàn)白血病融合基因的多重檢測(cè)體系均可特異、敏感地檢測(cè)白血病融合基因。體系1可有效檢測(cè)針對(duì)BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和E2A/PBX1這4種融合基因的6個(gè)突變型質(zhì)粒模板，即BCR/ABLe1a2型、PML/RA

7、RαS型、E2A/PBX1 I型、BCR/ABL e13a2型、PML/RARαL型和AML1/ETO型，其敏感性檢測(cè)結(jié)果依次為103，102，102，10，103和102拷貝。體系2針對(duì)BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα、E2A/PBX1、E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL、CBFβ/MYH11和SIL/TAL1這9種融合基因的11個(gè)突變型檢測(cè)模板，即BCR/ABL e13a2型、TEL/AML1型、BC

8、R/ABLe1a2型、PML/RARα的L型、PML/RARαS型、AML1/ETO、E2A/PBX1 I型、E2A/HLF型、TEL/ABL型、CBFβ/MYH11 A型和SIL/TAL1型，其敏感性檢測(cè)結(jié)果依次為：102，102，103，103，103，103，103，103，103，104，104拷貝。運(yùn)用這兩個(gè)多重體系對(duì)55例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果均與醫(yī)院臨床診斷結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　本課題構(gòu)建的基于公共