抗前列腺癌異種化PSCA融合抗原DNA疫苗實驗研究.pdf

1、[目的]選擇人前列腺干細胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)作為治療靶點，以本實驗室自主研發(fā)的pVAX1-neo-Fc-GPI-IRES-GM/B7 DNA疫苗載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建用于治療前列腺癌的異種化PSCA融合抗原免疫增效DNA疫苗，評價以PSCA作為前列腺癌治療靶點的可行性，并為前列腺癌，特別是激素非依賴性前列腺癌的治療提供新策略。
　　 [方法](1)檢索GenBank，選擇包含人主要T

2、細胞抗原表位序列的人PSCA基因片段，應(yīng)用異種化抗原設(shè)計技術(shù)，保留人T細胞抗原表位，設(shè)計異種化PSCA融合抗原片段；(2)根據(jù)核酸序列按中心模板法設(shè)計引物，應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)拼接合成異種化PSCA融合抗原片段基因，以PCR、限制性酶切和DNA序列測定法進行鑒定；(3)利用DNA限制性內(nèi)切酶BssH II和Mlu I酶切后粘端互補的特點，采用同尾酶法構(gòu)建1-4拷貝異種化PSCA融合抗原片段(PSCA1-PSCA4)，并將上述片段分別插

3、入真核表達載體pCI-neo-Fc-GPI中，轉(zhuǎn)染293T細胞，借助免疫熒光+流式細胞術(shù)考察插入片段表達效率，最終選定PSCA3片段進行下一步研究；(4)將sig-PSCA3-Fc-GPI基因片段自pCI-PSCA3-Fe-GPI質(zhì)粒上切下，插入pVAX1-neo-IRES-GM/B7載體中，構(gòu)建免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB，并應(yīng)用轉(zhuǎn)染Cos7細胞+免疫熒光/流式細胞術(shù)方法鑒定其在真核細胞中的表達情況；(5)給8周

4、齡雄性C57BL/6小鼠皮下種植RM-1細胞，制備小鼠前列腺癌模型，并采用股四頭肌肌肉注射+電脈沖法(Electroporation，EP)接種DNA疫苗質(zhì)粒pVAX1—PSCA3-FcGB，同時接種pVAX1空載體質(zhì)粒和pVAX1-PSCA1-FcGB質(zhì)粒作為對照，通過觀察計算免疫動物的成瘤時間、腫瘤體積和抑瘤率，來評價該DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的抑瘤效果。
　　 [結(jié)果](1)拼接合成了含有人主要T細胞表位的異種化PSCA融合抗

5、原片段基因，經(jīng)DNA測序證實與設(shè)計序列完全一致；(2)將異種化PSCA融合抗原片段進行1—4拷貝串聯(lián)后，轉(zhuǎn)染293T細胞+免疫熒光/流式細胞術(shù)結(jié)果證實PSCA3表達效率較高；(3)成功構(gòu)建了免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB，并通過轉(zhuǎn)染Cos7細胞+免疫熒光/流式細胞術(shù)檢測證明該疫苗可以在真核細胞中有效表達；(4)動物實驗證明抗前列腺癌免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB能夠推遲RM-1細胞腫瘤的形成，但在