雪里蕻滯綠基因SGR的克隆及轉化研究.pdf

1、綠色植物的葉片由于含有豐富的葉綠素而呈現(xiàn)綠色，植物物種間或者同一物種的不同時期可以呈現(xiàn)出不同的顏色也是由于不同的色素所造成的。其色素組成受遺傳和環(huán)境刺激的影響，是其合成與降解之間相互平衡的結果。近年來，葉綠素的合成途徑已經(jīng)研究的比較清楚，而對于其降解途徑，隨著水稻中sgr(t)滯綠突變體的發(fā)現(xiàn)及SGR基因的識別，研究者對于葉綠素降解的起始階段又有了新的認識。目前，SGR基因已經(jīng)在很多物種中被發(fā)現(xiàn)，它的功能缺失可以導致綠色植物出現(xiàn)滯綠突變

2、，但是其機制目前還不清楚。通過對更多的SGR基因及其滯綠突變體進行研究，對于探明SGR基因的作用機制及葉綠素降解途徑將有所幫助。
　　本課題中，我們分析了已報道的各物種SGR滯綠基因的同源性，并設計特異引物，分別克隆了雪里蕻和白菜的SGR基因的編碼區(qū)。對獲得的基因序列進行了生物信息學分析，并對雪里蕻SGR基因的表達模式進行了分析。為了進一步研究雪里蕻和白菜SGR基因的功能，本研究構建了雪里蕻和白菜SGR基因的RNAi沉默載體，并采

3、用了農(nóng)桿菌介導的花序浸染法和組織培養(yǎng)轉化法，進行了雪里蕻的遺傳轉化。本研究的主要結果如下：
　?、俪晒Φ目寺×搜├镛桶撞说腟GR基因的編碼區(qū)，測序結果表明，雪里蕻和白菜的SGR基因序列都是807bp，它們幾乎完全相同，只有三個堿基的差別。雪里蕻SGR基因與擬南芥NYE1的同源性為85％、烏塌菜91%、煙草77%、番茄76%等。
　　②通過生物信息學分析表明，雪里蕻和白菜的SGR基因都編碼了268個氨基酸殘基，并且序列完全相

4、同，分子量為30.3kD，等電點為8.56。同時雪里蕻SGR基因編碼的蛋白是一個具有N末端葉綠體轉運肽與信號肽的非分泌蛋白。在細胞亞結構中可能定位于葉綠體中，分布于葉綠體基質(zhì)、淀粉體。由于其不具跨膜結構，而又具有多個磷酸化位點，因此可能是在細胞中直接參與信號的傳導或者反應。其編碼的氨基酸序列和其它SGR蛋白有很高的同源性，并且和其它SGR蛋白一樣都含有一個高度保守的C末端基序(C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P)，與擬南芥NYE1

5、蛋白的同源性為87%、水稻61%。和蕓薹屬中烏塌菜的SGR蛋白的同源性為92%，除了中間插入的21個氨基酸外，只有一個氨基酸的差別。通過和其它物種的氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)，對于烏塌菜多出的21個氨基酸序列，除了結縷草的整個氨基酸序列較短外，其它物種中都不具有這個序列。這進一步說明這個序列很可能是后期插入的，而烏塌菜的SGR基因也可能因此造成功能缺失。
　?、垩├镛甋GR基因（Brassicajunceavar.crispifolia，

6、BjSGR）表達模式分析表明，BjSGR基因受衰老誘導而特異地表達。在幼嫩葉中表達量很低，而在綠色稍微褪去的衰老葉片中其表達量迅速增加。
　?、芡ㄟ^對擬南芥花序浸染法的探索和改進，采取用移液槍點滴重懸液的方式轉化雪里蕻(雪里蕻，Brassicajunceavar.crispifolia)花蕾，最終獲得了轉基因雪里蕻。同時通過對影響轉化效率的蔗糖濃度、表面活性劑濃度、菌液OD600值等進行研究，發(fā)現(xiàn)用5%的蔗糖(w/v)+0.03%

7、的Silwet-77(v/v)重懸農(nóng)桿菌，使重懸液的菌液濃度OD600為0.8時，可以獲得較高的轉化效率，轉化率為2.3%。該方法避免了真空操作及浸染時間的影響，使得操作更加簡便，且轉化周期更短，為雪里蕻的遺傳轉化提供了一種更為簡便的轉化方法。
　?、菰诮M織培養(yǎng)轉化法中，通過對外植體的選擇以及激素配比研究發(fā)現(xiàn)，2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA組的子葉的芽再生率較高，并且獲得了抗性苗，目前處于誘導生根階段。這為以后研究雪里蕻