雷公藤多甙調(diào)控NE、Trappin-2對HaCaT細(xì)胞增殖和炎癥的影響.pdf

1、目的:
　　通過構(gòu)建兩種體外損傷模型，NE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖模型和TNF-α與NE聯(lián)合誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥模型，研究雷公藤多甙對HaCaT細(xì)胞增殖活力、炎癥因子分泌以及ICAM-1表達的影響，探討其抑制HaCaT細(xì)胞增殖和炎癥細(xì)胞表達的作用機制。
　　方法:
　　1、用不同濃度NE在不同時間下刺激HaCaT細(xì)胞，通過比較細(xì)胞增殖活力及炎性因子的水平，確定NE的最適作用濃度和時間;分別用不同濃度Trappin-

2、2、TWP在不同時間下對HaCaT細(xì)胞進行細(xì)胞毒性檢測，確定Trappin-2和TWP的最適作用濃度及時間。
　　2、用NE誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞增殖模型，觀察TWP和Trappin-2干預(yù)下，HaCaT細(xì)胞增殖的改變。
　　3、用TNF-α和NE聯(lián)合誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞炎癥模型，觀察TNF-α和NE對HaCaT細(xì)胞增殖活力及炎癥因子表達的作用;給予TWP和Trappin-2進行干預(yù)，觀察TWP和Trappin-2的干預(yù)作用對模型

3、的影響。
　　4、用CCK-8試劑盒檢測HaCaT細(xì)胞增殖的變化。5、用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、NE與Trappin-2蛋白的水平。
　　6、用Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)的表達。
　　結(jié)果:
　　1、NE對HaCaT細(xì)胞增殖及其炎癥因子水平的影響
　　(1)NE以1和10IU/L的劑量預(yù)處理

4、12、24和48h后HaCaT細(xì)胞活力明顯增加(P＜0.05)，但是NE（50和100IU/L）預(yù)處理12、24和48h后HaCaT細(xì)胞活力則顯著降低(P＜0.05)。
　　(2)NE在濃度0.1-100IU/L預(yù)處理12、24和48h后對HaCaT細(xì)胞的IL-6、IL-8以及ICAM-1的表達水平略有改變，但與作用時間和濃度無明顯相關(guān)性，結(jié)果無顯著差異(P＞0.05)。
　　(3)低濃度NE顯著增加HaCaT細(xì)胞中的Tra

5、ppin-2水平，高濃度NE降低Trappin-2水平。
　　因此，選擇濃度10IU/L和刺激時間24h為NE的最適刺激濃度和作用時間。
　　2、Trappin-2對HaCaT細(xì)胞增殖的影響
　　10-100ng/ml的Trappin-2處理12h后HaCaT細(xì)胞增殖活力略有變化，結(jié)果無顯著性差異(P＞0.05)。但是，Trappin-2在25-100ng/ml濃度下預(yù)處理24或48h能顯著降低HaCaT細(xì)胞增殖活力(

6、P＜0.05)，且該改變呈劑量依賴性。綜合以上數(shù)據(jù)分析，選擇濃度25ng/ml和刺激時間24h為Trappin-2最適刺激濃度和最適作用時間。
　　3、TWP對HaCaT細(xì)胞增殖的影響
　　與對照組（TWP=0μg/ml）相比，TWP（1-100μg/ml）對HaCaT細(xì)胞增殖活力略有改變，結(jié)果無顯著性差異(P＞0.05)，表明HaCaT細(xì)胞在TWP(＜100μg/ml)時沒有明顯的毒性作用。并且與NE組相比，50μg/ml

7、的TWP處理24h后，能夠最大限度地降低NE對HaCaT的增值作用。綜上分析，最終確定濃度50μg/ml和刺激時間24h為TWP的最佳刺激濃度和時間。
　　4、TWP/Trappin-2對低濃度NE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖模型的影響
　　(1)TWP/Trappin-2對低濃度NE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞活力的影響
　　NE(10IU/L)預(yù)處理24h后與對照組相比HaCaT細(xì)胞活力明顯增加(P＜0.01)。此外，TWP和

8、Trappin-2對HaCaT細(xì)胞活力沒有明顯改變(P＞0.05)。但是相比于NE組，用TWP（50μg/ml）或Trappin-2(25ng/ml)處理24h可以顯著降低10IU/L NE處理24h后的HaCaT細(xì)胞活力(P＜0.05)。
　　(2)TWP/Trappin-2對低濃度NE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中NE和Trappin-2平衡的影響
　　NE(10IU/L)預(yù)處理24h后與對照組相比，HaCaT細(xì)胞中NE和Tra

9、ppin-2水平顯著上升(P＜0.01)。此外，TWP和Trappin-2對NE和Trappin-2水平未產(chǎn)生明顯改變。但是，和NE組相比，用TWP(50μg/ml)或Trappin-2(25ng/ml)處理24h可以顯著下調(diào)HaCaT細(xì)胞中NE水平并顯著上調(diào)Trappin-2水平(P＜0.05)。因此，HaCaT細(xì)胞中NE和Trappin-2的比值和對照組相比顯著增加，用50μg/ml TWP或25ng/ml Trappin-2處理2

10、4h可以顯著降低這個比例(P＜0.05)。
　　5、TWP/Trappin-2對TNF-α和聯(lián)合NE誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞炎癥模型的影響
　　(1)與對照組相比，TNF-α(10ng/ml)以及TNF-α+NE聯(lián)合處理HaCaT細(xì)胞后，IL-6、IL-8、NE和Trappin-2水平及NE/Trappin-2比值顯著增加(P＜0.05)。
　　(2)與TNF-α組和TNF-α+NE組相比，TWP處理TNF-α+NE聯(lián)合誘導(dǎo)

11、的HaCaT細(xì)胞模型后IL-6、IL-8和NE水平顯著降低，Trappin-2水平顯著增加(P＜0.05)。Trappin-2處理TNF-α+NE聯(lián)合誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞模型后IL-6、IL-8、NE和Trappin-2的表達與TWP的結(jié)果類似(P＜0.05)。
　　(3)與對照相比，TNF-α+NE處理后，HaCaT細(xì)胞表達ICAM-1蛋白的水平顯著增加(P＜0.05)。TWP/Trapin-2刺激TNF-α+NE聯(lián)合誘導(dǎo)的Ha

12、CaT細(xì)胞模型后，ICAM-1的表達顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.低濃度的NE(≤10IU/L)可以顯著增加HaCaT細(xì)胞活力和Trappin-2水平，而高濃度NE(≥50IU/L)則抑制HaCaT細(xì)胞活力，降低Trappin-2的表達。
　　2.在Trappin-2濃度大于25ng/ml，作用時間大于24h的情況下，HaCaT細(xì)胞的活力被顯著地抑制，并且不隨濃度的升高而發(fā)生變化。
　　3.TW

13、P濃度≤100μg/ml，作用時間≤48h，HaCaT細(xì)胞活力的改變無統(tǒng)計學(xué)意義，說明在此條件下，TWP對HaCaT細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒作用，并且不顯著改變NE和Trappin-2的表達。
　　4.TWP（50μg/ml）和Trappin-2(25ng/ml)處理24h，可以有效地抑制NE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖，并顯著降低NE水平，上調(diào)Trappin-2水平以及降低NE/Trappin-2比值。
　　5.TWP或Trappi