二去水衛(wèi)矛醇對肺癌NCI-H460細胞的影響及基于拓撲異構(gòu)酶Ⅱ探討其抗腫瘤作用.pdf

1、目的:評價二去水衛(wèi)矛醇(dianhydrogalactitol，DAG)對肺癌NCI-H460細胞的抗腫瘤作用，探討其抗腫瘤作用機制。
　　方法:(1) DAG對NCI-H460細胞增殖的影響。①采用CCK-8法、細胞克隆形成實驗，計算增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50，評價DAG對NCI-H460細胞的增殖抑制作用。②采用顯微拍照觀察不同濃度DAG給藥48 h后，肺癌NCI-H460細胞形態(tài)的改變。(2) DAG對NCI-H460

2、細胞遷移的影響。①采用劃痕實驗評價DAG對NCI-H460細胞橫向遷移的影響。②采用Transwell-migration小室模型評價DAG對NCI-H460細胞縱向遷移的影響。(3) DAG對NCI-H460細胞DNA、Ca2+和線粒體膜電位的影響。①采用Hoechst33342染色檢測DAG對細胞核染色質(zhì)的影響。②采用單細胞凝膠電泳檢測DAG對細胞DNA的損傷作用。③采用Fluo-3 AM為Ca2+熒光探針，檢測DAG對細胞內(nèi)Ca2

3、+的影響。④采用Rhodamine123(Rhm123)為線粒體膜電位熒光探針，檢測DAG對細胞線粒體膜電位的影響。(4)DAG對TopoⅡα、TopoⅡβ的影響。①采用Real-time PCR法檢測拓撲異構(gòu)酶Ⅱα(TopoⅡα)、拓撲異構(gòu)酶Ⅱβ(TopoⅡβ) mRNA的表達水平。②采用Western blot法檢測TopoⅡα、TopoⅡβ蛋白表達水平。③應用計算機模擬分子對接技術(shù)預測DAG與TopoⅡα、TopoⅡβ的相互作用。

4、
　　結(jié)果:(1) CCK-8法檢測結(jié)果顯示，DAG對NCI-H460細胞的體外抗腫瘤活性顯著，與對照組比較有顯著性差異，其48 h的IC50為9.68±1.02μg/mL。細胞克隆形成實驗結(jié)果表明，DAG能持續(xù)抑制腫瘤細胞的增殖。(2)劃痕實驗和Transwell-migration小室檢測結(jié)果表明，DAG能抑制腫瘤細胞的遷移。(3) Hoechst33342檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，DAG使細胞核染色質(zhì)發(fā)生明顯改變，與空白對照組比

5、較，各給藥組細胞均不同程度出現(xiàn)細胞變圓縮小、貼壁能力減弱、胞漿內(nèi)顆粒邊緣化甚至細胞破碎等損傷現(xiàn)象;此外，單細胞凝膠電泳檢測出DAG可導致DNA損傷。Fluo-3 AM熒光染色結(jié)果顯示，與空白對照組比較，各給藥組熒光強度增強，即細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，說明DAG誘導細胞凋亡與細胞內(nèi)Ca2+濃度增加有關(guān);Rhm123熒光染色結(jié)果顯示，與空白對照組比較，各給藥組熒光強度減弱，表明DAG使細胞線粒體膜電位下降，即DAG誘導細胞凋亡與線粒體膜電位

6、下降有關(guān)。(4) Real-time PCR檢測結(jié)果顯示不同濃度的DAG均能明顯降低TopoⅡα、TopoⅡβ mRNA表達量降低;Western blot檢測表明，DAG明顯使TopoⅡα、TopoⅡβ蛋白表達量降低，提示DAG誘導細胞凋亡與下調(diào)TopoⅡα、TopoⅡβ有關(guān);計算機模擬分子對接顯示DAG與TopoⅡα、TopoⅡβ有相互結(jié)合作用。
　　結(jié)論:(1) DAG能顯著抑制NCI-H460細胞的增殖。(2) DAG能顯