PEBP4在非小細(xì)胞肺癌分化轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、背景:肺癌為當(dāng)前世界各地最常見的惡性腫瘤之一,是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,隨著肺癌發(fā)病率和死亡率的不斷升高,肺癌越來越引起廣大研究者的關(guān)注?；熑匀皇欠伟┲委煹某Ｓ梅椒?因此,探尋與研究肺癌化療敏感性相關(guān)基因是一項迫在眉睫的任務(wù),藉此提高肺癌患者生存率,改善預(yù)后。隨著人類基因組計劃的完成及分子生物學(xué)的發(fā)展,人們在基因水平上對腫瘤的發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識取得了很大的成就,但離攻克癌癥仍然有很遠(yuǎn)的路要走。
　　PEBP4屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合

2、蛋白家族的成員,不僅參與MAPK信號通路的抑制作用,還參與JNK通路的抑制,促進(jìn)AKT的激活,近年來研究數(shù)據(jù)表明PEBP4蛋白的過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PEBP4在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)均高于其在正常對照組中的表達(dá),在腫瘤組織中高表達(dá)的PEBP4可能使腫瘤細(xì)胞對TNF-α(tumor necrosis factor-α) or TRAIL(tumor necrosis factor-relat

3、ed apoptosis-inducing ligand)引起的凋亡起抵抗作用。但有關(guān)PEBP4是否在肺鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)以及與肺鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究仍未見相關(guān)報道。
　　本課題研究了PEBP4的表達(dá)與肺非小細(xì)胞癌的臨床病理的相關(guān)性以及PEBP4在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和腫瘤靶向治療提供實驗依據(jù)。本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 PEBP4蛋白在肺非小細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

4、及其意義
　　目的:本研究旨在探討PEBP4蛋白在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與肺鱗狀細(xì)胞癌臨床病理的相關(guān)性。
　　方法:采用免疫組織化學(xué)方法檢測61例肺鱗狀細(xì)胞癌組織及其癌旁正常組織中PEBP4蛋白的表達(dá),計算其陽性率;并Western blot方法檢測肺鱗狀細(xì)胞癌組織及其癌旁正常組織中PEBP4蛋白的表達(dá)變化,用RT-PCR和Western blot方法檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和陰性患者癌組織中mRNA和蛋白表達(dá)情況。

5、　　結(jié)果:PEBP4蛋白在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肺組織(p<0.05);PEBP4 mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者癌組織中的表達(dá)量顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者(p<0.05),PEBP4蛋白的表達(dá)也顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者(p<0.05),;PEBP4蛋白在早期(I,II)患者中的表達(dá)顯著低于中晚期(III,IV)患者(p<0.05),且隨著肺鱗狀細(xì)胞癌組織分化程度降低,PEBP4蛋白的表達(dá)越高(p<0.05),但與患者

6、的性別、年齡、腫瘤的大小等無關(guān)(p<0.05)。
　　結(jié)論:PEBP4蛋白的高表達(dá)可能與肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　第二部分 PEBP4基因表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系
　　目的:探討 PEBP4基因?qū)τ诜切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞生長、增殖、凋亡及浸潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響,為將來人非小細(xì)胞肺癌的生物治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:采用Western blot方法檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(HCC827,A5

7、49,NCI-H661, NCI-H292 and95-D)中PEBP4蛋白的表達(dá)情況,再用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)HCC827細(xì)胞中PEBP4表達(dá),觀察HCC827細(xì)胞侵襲能力。用PEBP4-siRNA干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人HCC827細(xì)胞,檢測相關(guān)生物學(xué)行為。
　　結(jié)果:PEBP4在肺癌細(xì)胞系(HCC827,A549,NCI-H661,NCI-H292 and95-D)中的高表達(dá),在正常支氣管細(xì)胞中呈低表達(dá)。PEBP4干擾組HCC8

8、27細(xì)胞的活力、增殖能力以及遷移能力明顯低于陰性對照組和空白對照組 HCC827細(xì)胞(p<0.05), PEBP4干擾組發(fā)生凋亡的HCC827細(xì)胞所占比例明顯高于陰性對照組和空白對照組(p<0.05),PEBP4干擾組HCC827細(xì)胞中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對照組和空白對照組(p<0.05),p53蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對照組和空白對照組(p<0.05)。
　　結(jié)論:PEB

9、P4基因可能具有促進(jìn) HCC827細(xì)胞生長增殖及其侵襲遷移能力,抑制HCC827細(xì)胞凋亡的作用,PEBP4基因的表達(dá)下調(diào)可能與人非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞遷移能力下降、凋亡能力增加有關(guān)。
　　第三部分 PEBP4的異位表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性之間的關(guān)系
　　目的:檢測肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中 PEBP4的異位表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性之間的關(guān)系,并探討其相關(guān)作用機(jī)制。為將來PEBP4在人肺癌的化療中應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法:構(gòu)建p

10、cDNA3-PEBP4重組質(zhì)粒,將pcDNA3-PEBP4重組質(zhì)粒和PEBP4 shRNA轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549,Western Blot檢測各組A549細(xì)胞中PEBP4的表達(dá)。MTT分別檢測pcDNA3-PEBP4重組質(zhì)粒和PEBP4 targeting shRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞,在順鉑(DDP)作用48小時后,各組A549細(xì)胞活力的變化;利用流式細(xì)胞儀檢測各組A549細(xì)胞凋亡的變化;并利用Western Blot檢測各組A549細(xì)

11、胞中p53蛋白的表達(dá)變化。應(yīng)用熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證PEBP4是miR-34a的靶基因。采用Western blot方法檢測miR-34a對A549細(xì)胞中PEBP4蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了pcDNA3-PEBP4重組表達(dá)質(zhì)粒。pcDNA3-PEBP4重組質(zhì)粒和PEBP4 targeting shRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后,Western Blot結(jié)果顯示:pcDNA3-PEBP4轉(zhuǎn)染組PEBP4蛋白的表達(dá)顯著高于正常

12、對照組和PEBP4 shRNA轉(zhuǎn)染對照組(p<0.05);PEBP4 targeting shRNA轉(zhuǎn)染組,PEBP4蛋白的表達(dá)顯著下降(p<0.05)。DDP作用48h后, MTT結(jié)果顯示:DDP加藥組的A549細(xì)胞活力顯著低于正常對照組(p<0.05);pcDNA3-PEBP4轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞活力低于正常對照組(p<0.05),卻高于DDP加藥組和PEBP4 shRNA轉(zhuǎn)染組(p<0.05);PEBP4 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力則

13、顯著低于正常對照組p<0.05)和DDP加藥組(p<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果和Western Blot結(jié)果顯示:DDP加藥組的凋亡細(xì)胞數(shù)和p53蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常對照組(p<0.05);pcDNA3-PEBP4轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞數(shù)和 p53的表達(dá)水平高于正常對照組(p<0.055),卻低于DDP加藥組和PEBP4 shRNA轉(zhuǎn)染組(p<0.05);PEBP4 shRNA轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞數(shù)和p53的表達(dá)水平則顯著高于正常對照組(p

14、<0.05)和DDP加藥組(p<0.05)。熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-34a mimic組的相對熒光素酶活力顯著降低(p<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a mimic48h后,細(xì)胞中PEBP4蛋白的表達(dá)顯著下降(p<0.01)。
　　結(jié)論:PEBP4的過表達(dá)降低A549細(xì)胞對DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感性,這一過程主要通過影響p53蛋