CD123與急性髓系白血病預(yù)后的關(guān)系及靶向CD123的嵌合抗原受體T細(xì)胞體外細(xì)胞毒性研究.pdf

1、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是骨髓造血干/祖細(xì)胞不同成熟階段分化受阻，進(jìn)而阻礙正常造血的一種高度異質(zhì)性血液腫瘤。其標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療方案已經(jīng)近50年未曾改變過，目前仍是一種預(yù)后較差的急性白血病類型，5年生存率僅20％左右，多數(shù)AML患者化療耐藥或最終復(fù)發(fā)。大量研究發(fā)現(xiàn)CD123廣泛高表達(dá)在AML干/祖細(xì)胞(leukaemia stem cells，LSCs)表面，而低表達(dá)或不表達(dá)在正常造血干/祖細(xì)胞(

2、hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs)中，且已證實CD123高表達(dá)與AML不良預(yù)后有關(guān)，因此，CD123已成為AML嵌合抗原受體(chimericantigen receptors，CARs)T細(xì)胞免疫治療新的理想靶點。
　　本研究第一部分我們回顧性分析了CD123在初診AML(非APL)患者中的表達(dá)分布及與生存預(yù)后的關(guān)系，探討表達(dá)CD123的AML患者是否更易誘導(dǎo)化療失敗及伴有更差的

3、生存預(yù)后，從而為靶向CD123的CART細(xì)胞免疫治療AML提供理論基礎(chǔ)。本研究第二部分則是通過構(gòu)建靶向CD123的CAR慢病毒載體，制備具有高轉(zhuǎn)染效率的CART123細(xì)胞，體外試驗驗證CART123對CD123+AML原代細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，明確CART123細(xì)胞的有效性，為臨床難治復(fù)發(fā)CD123+AML患者提供新的治療選擇。
　　第一部分 CD123在急性髓系白血病細(xì)胞中的表達(dá)及預(yù)后價值研究
　　研究目的：回顧性分析CD1

4、23在137例初診AML患者中的表達(dá)分布及與患者生存預(yù)后的關(guān)系。
　　研究方法：回顧性分析2012年1月至2015年12月我院血液科收治的137例初診AML（M3除外）患者CD123表達(dá)情況，收集患者基本臨床資料，包括年齡、性別、初診白細(xì)胞計數(shù)、初診骨髓原始細(xì)胞比例、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)異常、是否移植、是否達(dá)CR1以及CD123表達(dá)。初診時多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測CD123表達(dá)占骨髓白血病細(xì)胞群≥20％定義為陽性。使用SPSS21軟

5、件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有計數(shù)資料采用“頻數(shù)”(％)表示，計量資料采用“中位數(shù)”表示，兩組間比較采用卡方檢驗、Mann-Whitney U檢驗或Fisher確切概率法，生存資料分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用log-rank檢驗，完全緩解率(CR1)采用非條件Logistic回歸分析，生存分析采用COX比例風(fēng)險模型進(jìn)行單因素和多因素分析，所有多變量回歸分析均列出OR或HR以及95％的置信區(qū)間用于風(fēng)險評估，所有檢驗均為雙

6、側(cè)檢驗，統(tǒng)計檢驗結(jié)果P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：1、137例初診AML患者中，男性70例(51.2％)，女性67例(48.9％)，中位年齡46歲（13-72歲），其中CD123+組84例(61.3％)，CD123-組53例(38.9％)，按FAB/WHO分型M1-M6中CD123表達(dá)率分別為60.0％(3/5)、48.5％(16/33)、70.8％(34/48)、68.4％(26/38)、50.0％(4/8)

7、，未分類者20.0％(1/5);其中M1、M4、M5的CD123表達(dá)陽性率相對較高，M2、M6表達(dá)稍偏低，M4與M2比較有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.042)。所有病例根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)及分子學(xué)異常進(jìn)行危險分組，分別為預(yù)后良好組（28例）、預(yù)后中等組（74例）和預(yù)后不良組（35例），結(jié)果顯示三組CD123表達(dá)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異;
　　2、分析患者臨床參數(shù)及常見突變基因與CD123表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)初診高白細(xì)胞計數(shù)(P=0.001)、CR

8、1(P=0.027)與CD123表達(dá)明顯相關(guān)，其余臨床指標(biāo)均與CD123表達(dá)無明顯相關(guān)性;
　　3、療效分析顯示，137例AML患者總CR1率為62.0％(85/137)，CD123+組與CD123-組CR1率分別為54.8％(46/84)、73.6％(39/53)，差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.027); Logistic回歸模型分析顯示，初診骨髓原始細(xì)胞比例(P=0.021)及CD123表達(dá)(P=0.024)是AML患者CR1

9、的獨立危險因素;至隨訪終點，完全緩解患者共有52例復(fù)發(fā)，總復(fù)發(fā)率46.8％(52/111)，CD123+組與CD123-組分別為50.8％(32/63)、41.7％(20/48)，兩組復(fù)發(fā)率比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.340);
　　4、生存分析顯示，CD123+組和CD123-組相比有明顯更短的OS(P=0.015)，但兩組DFS比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.086);多因素分析顯示CD123表達(dá)是影響AML患者OS的獨立不良

10、預(yù)后因素。將所有患者進(jìn)行危險分層后，發(fā)現(xiàn)預(yù)后中等組中CD123+組和CD123-組比較OS(P=0.035)及DFS(P=0.029)均明顯降低。進(jìn)一步將患者按年齡分組后，發(fā)現(xiàn)年齡≤50歲組CD123表達(dá)是患者預(yù)后的獨立危險因素，兩組OS(P=0.003)和DFS(P=0.006)比較有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　研究結(jié)論：1、CD123在初診AML患者中廣泛高表達(dá)，其中M4型CD123表達(dá)百分比最高。初診高白細(xì)胞計數(shù)與CD123表達(dá)呈

11、正相關(guān);2、CD123表達(dá)是影響AML患者CR1的獨立危險因素，可用來評估患者治療療效;3、CD123表達(dá)患者有更差的OS，但對患者的DFS并無明顯影響;4、將全部患者按危險分層及年齡分組后，發(fā)現(xiàn)在預(yù)后中等組及年齡≤50歲組中CD123表達(dá)能更好地預(yù)測患者生存預(yù)后。
　　第二部分 靶向CD123的嵌合抗原受體T細(xì)胞體外抗白血病作用研究
　　研究目的：構(gòu)建靶向CD123的CAR慢病毒載體，制備具有高轉(zhuǎn)染效率的CART123細(xì)胞

12、，體外試驗驗證CART123對CD123+AML原代細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，明確CART123的有效性，為臨床治療CD123+難治復(fù)發(fā)AML患者提供試驗基礎(chǔ)。
　　研究方法：采用Ficoll密度梯度離心法分離健康志愿者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，CD3/CD28+IL-2激活2-3天，轉(zhuǎn)染以4-IBB作為共刺激分子的CD123-CAR慢病毒，體外擴增8天后，qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率、流式細(xì)胞術(shù)檢測(FACS)細(xì)胞表型，流式CountBr

13、ight磁珠絕對計數(shù)法驗證CART123體外靶向殺傷能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測效靶細(xì)胞共培養(yǎng)后CD107α釋放及細(xì)胞因子分泌情況。
　　研究結(jié)果：1、成功構(gòu)建CD123T28z和CD123TBBz兩種結(jié)構(gòu)的CD123 CAR慢病毒載體，CD123TBBz能有效轉(zhuǎn)染激活的健康供者T淋巴細(xì)胞細(xì)胞，獲得高轉(zhuǎn)染效率及合適CD4/CD8細(xì)胞亞群比例的CART123細(xì)胞;2、CART123與CD123+AML原代細(xì)胞體外共培養(yǎng)后表現(xiàn)出顯著的CD10