hTfR基因載體的構(gòu)建與鑒定及在Hela細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、研究目的：人類轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(human Transferrin receptor,hTfR)是一種廣泛分布于細(xì)胞膜的跨膜糖蛋白,通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白的特異性結(jié)合來介導(dǎo)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn),與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等有密切聯(lián)系。它在大多數(shù)成熟的正常細(xì)胞中表達(dá)水平較低,而在多種腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá),結(jié)合分子探針技術(shù),使得hTfR可以作為比較理想的MR分子影像報(bào)告基因。本研究運(yùn)用hTfR作為MR報(bào)告基因,制作包含hTfR蛋白編碼區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒,并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)鑒定,

2、為下一步體外、體內(nèi)MR分子影像研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法：于Yr基因庫(kù)中購(gòu)買包含hTfR基因cDNA的表達(dá)質(zhì)粒,參考Gene-Bank(No.BC001188)的信息合成引物,運(yùn)用RT-PCR方法對(duì)hTfR基因的蛋白編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)酶切、連接之后構(gòu)建pcDNA3.1(+)-hTfR的表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)鑒定及測(cè)序正確后按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,使該細(xì)胞過量表達(dá)hTfR。運(yùn)用PCR及Westen-Blot的方法在基因水平和蛋

3、白水平檢測(cè)hTfR在轉(zhuǎn)染前后的表達(dá)水平,鑒定轉(zhuǎn)染效果。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pCDNA3.1(+)-hTfR過表達(dá)質(zhì)粒,測(cè)序鑒定正確;通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染pCDNA3.1(+)-hTfR質(zhì)粒組較對(duì)照組生成的hTfR mRNA明顯增高(P＜0.05);Western-Bolt顯示轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組編碼的TfR蛋白明顯增高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了pCDNA3.1(+)-hTfR表