TGF-β受體亞型糖基化修飾對肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的影響.pdf

1、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IdiopathicPulmonaryFibrosis，IPF）嚴(yán)重威脅人類健康和生命，其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，死亡率高。由于其發(fā)病機(jī)制不十分清楚，目前尚無有效的治療方法。雖然肺組織已形成的纖維化不可逆轉(zhuǎn)，但肺間質(zhì)纖維化是一個慢性的、進(jìn)行性的病理反應(yīng)過程，探索肺間質(zhì)纖維化發(fā)病的分子機(jī)制及新的干預(yù)靶點(diǎn)以延緩或阻止肺纖維化進(jìn)展的策略，仍具有重要的實(shí)際意義，是國際肺科學(xué)界一直關(guān)注的焦點(diǎn)。在肺纖維化的發(fā)展過程中，轉(zhuǎn)化生長因子

2、-β(Transforminggrowthfactorβ，TGF-β)起著關(guān)鍵作用。活化的TGF-β，在Ⅲ型受體的調(diào)節(jié)作用下，首先與肺成纖維細(xì)胞膜上的2個Ⅱ型受體結(jié)合，再募集2個Ⅰ型受體形成復(fù)合體，磷酸化Ⅰ型受體的激活型G蛋白(stimulatoryGprotein，Gs)功能域，成為活化狀態(tài)，活化的Ⅰ型受體進(jìn)一步磷酸化下游信號分子Smads蛋白。但具體哪幾個TGF-βⅠ型受體亞型參與肺纖維化的過程尚不清楚。通過基因芯片技術(shù)，我們對博來

3、霉素致大鼠肺間質(zhì)纖維化模型中7個TGF-βⅠ型受體亞型(又稱活化樣受體樣激酶，activinreceptor-likekinase，ALK)的研究發(fā)現(xiàn):ALK4，ALK5，ALK7表達(dá)增高，為進(jìn)一步明確以上三種TGF-βⅠ型受體亞型肺間質(zhì)纖維化發(fā)生和發(fā)展中的分布和變化規(guī)律，我們應(yīng)用實(shí)時定量PCR和蛋白免疫印記、免疫組化技術(shù)分析ALK4，ALK5和ALK7在纖維化不同時期的表達(dá)變化。
　　 對ALK5的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)其表面存在核心巖

4、藻糖基化修飾位點(diǎn)，TGF-βRⅡ也屬于糖蛋白，它須經(jīng)過由α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移(α1，6-fucosyltransferase8，F(xiàn)UT8)催化的核心巖藻糖基化修飾，然后才具備與TGF-β1結(jié)合的功能。因此，F(xiàn)UT8是TGF-β受體糖基化修飾的重要酶。FUT8還可以促進(jìn)間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，對纖維化的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著重要作用。而FUT8在肺間質(zhì)纖維化中的研究少見報道。我們利用TGF-β1誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞WI-38纖維化模型，來

5、研究兩種受到核心糖基化修飾的TGF-βRⅠ(ALK5)和TGF-βRⅡ，探討它們的糖基化修飾作用是否參與了TGF-β1誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化過程。
　　 IPF不僅病因譜極為廣泛和復(fù)雜，同時在進(jìn)展過程中存在多個病理生理過程參與、多個信號通路活化，因此，從理論上來講，其治療也應(yīng)該是多靶點(diǎn)的，單一阻抑某一個靶點(diǎn)，或某一種發(fā)病機(jī)制，或某個信號傳導(dǎo)通路可能獲得部分療效，但不能最終阻止肺纖維化的進(jìn)展。而蛋白質(zhì)的糖基化修飾可以作用于多個蛋白靶點(diǎn)

6、，從而實(shí)現(xiàn)疾病狀態(tài)下的多靶點(diǎn)的同時調(diào)控。目前國內(nèi)外治療IPF的傳統(tǒng)方法是糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，療效不佳。多味中藥聯(lián)合因其化學(xué)成分多樣，藥理活性廣泛，作用多靶點(diǎn)及多效性、意向性及毒副作用小等特點(diǎn)，非常符合多靶點(diǎn)治療肺纖維化策略?；钛龇橹嗅t(yī)學(xué)八大治則之一，眾多醫(yī)家嘗試用血府逐瘀湯等這些方劑學(xué)中有名的活血化瘀方劑治療肺纖維化，均取得了不錯的療效。組方中當(dāng)歸等可以干擾TGF-β/Smad2/3信號通路對基因表達(dá)、蛋白合成的調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)對大

7、鼠肺纖維化的治療作用。而在TGF-β/Smad2/3信號通路中，受體的糖基化修飾是TGF-β發(fā)揮重要生物學(xué)作用的關(guān)鍵步驟。我們應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段去探討活血化瘀方劑對TGF-β受體糖基化修飾的影響，為活血化瘀方劑治療肺間質(zhì)纖維化提供理論依據(jù)。
　　 第一部分：
　　 探討ALK4，ALK5，ALK7在博來霉素致大鼠肺間質(zhì)纖維化中的表達(dá)
　　 目的:明確TGF-βⅠ型受體亞型(ALK4，ALK5，ALK7)在正常大鼠肺

8、組織和博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺間質(zhì)纖維化肺組織中的分布和變化規(guī)律;探討特異性TGF-βⅠ型受體亞型在肺間質(zhì)纖維化中的表達(dá)，綜合分析TGF-βⅠ型受體亞型在肺間質(zhì)纖維化發(fā)生和發(fā)展中的分布和變化規(guī)律，為防治肺間質(zhì)纖維化提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:雌性SD大鼠56只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組（N組）和肺間質(zhì)纖維化模型組（1，3，7，14，28，35天組），每組7只。對肺組織進(jìn)行石蠟包埋組織學(xué)檢測，同時應(yīng)用實(shí)時定量PCR和蛋白免疫

9、印記、免疫組化技術(shù)分析ALK4，ALK5和ALK7在纖維化不同時期的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:ALK-4、ALK-5和ALK-7mRNA和蛋白表達(dá)于第1天出現(xiàn)上升并隨纖維化時間延長逐漸增高，ALK-4于14天達(dá)到最高峰，在第28天有所回落，而ALK-5和ALK-7于28天達(dá)到最高峰，在第35天有所回落。免疫組化可見ALK4，ALK5和ALK7在正常和纖維化時的肺泡上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞上均有表達(dá)。
　　 結(jié)論:

10、ALK4，ALK5和ALK7均在肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中高表達(dá)。
　　 第二部分：
　　 探討FUT8對肺間質(zhì)纖維化ALK5/TGF-βRⅡ/Smad2/3轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 目的:利用TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化模型，研究兩種TGF-β受體—TGF-βRⅡ和TGF-βRⅠ(ALK5)核心巖藻糖基化修飾，探討它們的糖基化修飾作用是否參與了TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎肺成纖維細(xì)胞(human

11、embryoniclungfibroblastsWI-38)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化;阻斷TGF-β受體的糖基化修飾是否可以阻斷Smad2/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少其下游MMP-9，TIMP-1的表達(dá)。
　　 方法:體外培養(yǎng)的WI-38細(xì)胞隨機(jī)分為六組:(1)N組，單獨(dú)的DMEM培養(yǎng);(2)FUT8-siRNA組，轉(zhuǎn)染FUT8-siRNA并持續(xù)孵育72h;(3)TGF組，加入濃度為10ng/ml的TGF-β1孵育48h;(4)TGFM組，

12、首先用亂序siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞并孵育24h，然后加入10ng/mlTGF-β1繼續(xù)孵育48h;(5)TGFFs組，先用FUT8-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞并孵育24h，然后加入10ng/mlTGF-β1繼續(xù)孵育48h;(6)TGFFsF組，F(xiàn)UT8-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞并孵育24h，然后加入10ng/mlTGF-β148h后加入;加入Fut8蛋白5ng/ml繼續(xù)孵育24小時。我們用免疫熒光的方法確定了WI-38細(xì)胞表面有豐富的核心巖藻糖鏈表達(dá)，然后

13、用流式細(xì)胞儀檢測a-SMA，用實(shí)時定量PCR技術(shù)，免疫印記技術(shù)、免疫熒光檢測FUT8-siRNA干擾后各組細(xì)胞的ALK5，TGF-βRⅡ和核心巖藻糖鏈表達(dá)，用實(shí)時定量PCR技術(shù)、免疫印記技術(shù)檢測p-Smad2/3，MMP-9，TIMP-1的變化。
　　 結(jié)果:加入TGF-β1導(dǎo)致WI-38細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，可見細(xì)胞肥大、拉長;TGF-β1刺激能夠增加WI-38細(xì)胞FUT8-siRNA以及蛋白表達(dá)水平，能激活TGF-β/S

14、mad2/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，上調(diào)TGF-β-RⅡ和ALK5蛋白表達(dá)水平，最終導(dǎo)致WI-38細(xì)胞中p-Smad2/3表達(dá)水平升高;FUT8-siRNA可以一定程度的抑制由于TGF-β1所致肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)變化，與對照組相比，TGFF組細(xì)胞基本保持正常的成纖維細(xì)胞形態(tài);FUT8-siRNA能有效抑制p-smad2/3過表達(dá)，F(xiàn)UT8-siRNA能抑制TGF-βRⅡ和ALK5的核心糖基化表達(dá)水平，但對由于TGF-β1所致的二者蛋白增

15、高沒有影響;FUT8-siRNA能夠明顯削弱由TGF-β1導(dǎo)致的WI-38細(xì)胞的α-SMA，MMP-9和TIMP-1的高表達(dá)，以上的抑制作用可以通過加入外源性FUT8緩解。
　　 結(jié)論:沉默F(xiàn)UT8基因能夠抑制TGF-βRⅡ和ALK5的核心巖藻糖基化修飾，導(dǎo)致致纖維化細(xì)胞因子途徑TGF-β/Smad2/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活受到抑制，最后使抑制WI-38細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，并使TGF-β/Smad2/3下游的α-SMA，M

16、MP-9和TIMP-1的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步認(rèn)識肺間質(zhì)纖維化的翻譯后修飾機(jī)制提供了線索，可能成為一種新的抗肺間質(zhì)纖維化的治療策略。
　　 第三部分：
　　 探討活血化瘀方劑對肺成纖維細(xì)胞TGF-β/Smad2/3糖基化修飾的影響
　　 目的:明確活血化瘀方劑是否影響TGF-β/Smad2/3信號通路中TGF-β受體糖基化修飾，用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段闡明活血化瘀方劑治療肺間質(zhì)纖維化的機(jī)理。
　　 方法:WI-

17、38細(xì)胞隨機(jī)分為三組:(1)N組，單獨(dú)的DMEM培養(yǎng);(2)TGF組，加入濃度為10ng/ml的TGF-β1孵育48h;(3)TGFH組，先用10％含藥血清孵育24h，然后加入10ng/mlTGF-β1繼續(xù)孵育48h，應(yīng)用熒光定量PCR、免疫熒光、免疫印記技術(shù)檢測WI-38細(xì)胞的FUT8、細(xì)胞的巖藻糖基化水平，TGF-β受體ALK5及TGF-βRⅡ的表達(dá)，應(yīng)用ELISIA技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原纖維(collagenⅠ、Ⅲ、

18、Ⅳ，COLⅠ、Ⅲ、Ⅳ)和FN的變化。
　　 結(jié)果:活血化瘀方劑能明顯地抑制WI-38細(xì)胞的FUT8的表達(dá)和細(xì)胞的巖藻糖基化水平，活血化瘀方劑對TGF-β受體ALK5及TGF-βRⅡ的表達(dá)無明顯影響，但可以減少TGF-β1對WI-38細(xì)胞p-Smad2/3的影響，使其表達(dá)降低。COLⅠ在TGF組中表達(dá)約為正常組的1.5倍，TGFH組略高于正常組;COLⅢ在TGF組中表達(dá)約為正常組的2.5倍，TGFH組略高于正常組;COLⅣ在TGF