MiR-200a與膽道閉鎖患兒肝纖維化的相關研究.pdf

1、膽道閉鎖（biliary atresia, BA）為嬰幼兒時期一種以肝內外膽管炎癥和纖維化梗阻為特征的嚴重性肝病，是新生兒期阻塞性黃疸的常見原因，亦是兒童肝移植的首列疾病。該病發(fā)病率為活產(chǎn)兒的1/19000～1/5000，具有區(qū)域差異，以中國、日本等亞洲地區(qū)多見。異常迅猛的肝纖維化進程可使患兒在出生后短短幾周內就發(fā)展為肝硬化，未經(jīng)治療的患兒常在2歲以內死于肝衰竭。肝門空腸吻合術(Kasai術)是臨床上僅有的有效治療方法，然而Kasai術

2、頂多是延長患兒自體肝生存時間、等待肝移植的姑息方法，而不能解除根本的致病因素。即使成功的Kasai術也未能阻止患兒進行性的肝纖維化病變，70％～80%的患兒最后仍需要進行肝移植。BA肝纖維化發(fā)展快速，導致預后較差。而BA的病因和發(fā)病機制仍不清楚，BA快速肝纖維化的機制也尚未闡明。
　　大量研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）通過負性調控靶基因的表達而在不同疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miR-106b在慢性乙型

3、肝炎相關的肝硬化患者血漿中水平下降，而miR-181b水平上升。血漿miR-20a與丙肝引起的肝纖維化進展正相關，而miR-92a與丙肝引起的肝纖維化進展負相關。在前期研究中，本課題組通過二代高通量測序技術檢測了BA患兒血漿中miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-200a在BA血漿中的表達比正常對照組顯著升高。miR-200a在多種器官纖維化中存在異常表達。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition， E

4、MT）被證實在器官纖維化中起著關鍵作用，而許多研究表明miR-200a能抑制EMT過程。本研究通過檢測BA患兒肝組織miR-200a及EMT相關蛋白的表達，探討miR-200a及EMT通路在BA肝纖維化中的作用。
　　目的:
　　探討miR-200a及EMT通路在膽道閉鎖肝纖維化過程中的作用，為闡明疾病的發(fā)病機制及尋找治療靶標提供線索。
　　方法:
　　1.以實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測BA患兒、正常對

5、照組與疾病對照組血漿miR-200a的相對表達量，研究BA患兒循環(huán)miR-200a水平與肝纖維化程度及血纖維化指標（天冬氨酸轉氨酶與血小板比值，APRI)、肝生化參數(shù)之間的關聯(lián)。結果以2-ΔΔCt表示，中位數(shù)（P25，P75）描述。
　　2.患兒肝組織以HE及Masson染色，根據(jù)Ishak系統(tǒng)對BA肝組織進行肝纖維化及炎癥評分。將BA肝組織標本評分為1、2、3的視為低纖維化組，評分為4、5、6的歸為高纖維化組；將肝組織炎癥評分<

6、10的視為輕度炎癥組，評分≥10的合為重度炎癥組。
　　3.采用酪胺信號放大熒光原位雜交技術(TSA-FISH)原位示蹤miR-200a在BA患兒肝組織中的分布情況，并比較高、低纖維化組患兒間及輕、重度炎癥組患兒間miR-200a表達差異，分析miR-200a與BA肝纖維化及炎癥的相關性。熒光強度以均數(shù)±標準差表示。
　　4.同時采用免疫組化檢測EMT通路中的鋅指結構蛋白1（ZEB1）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、

7、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）在BA患兒和正常對照組肝組織中的表達情況，研究miR-200a與ZEB1通路相關蛋白的關系。結果以陽性染色面積百分比表示，均數(shù)±標準差或中位數(shù)描述。
　　結果:
　　1. BA組、疾病對照組和正常對照組血漿miR-200a相對含量分別為2.95（1.63，7.23）、2.33（1.33，5.68）、1.35（0.42，2.20）。BA組血漿miR-200a水平顯著高于正常對照組（u=38.50，

8、P<0.01），但與疾病對照組無統(tǒng)計學差異（u=97.00， P>0.05）。BA患兒血漿miR-200a水平與肝纖維化分級無顯著相關（r=﹣0.66， P>0.05），低纖維化組與高纖維化組間亦無明顯差別（u=54.50，P>0.05）。BA患兒血漿miR-200a水平高低與APRI值及肝生化指標值（TB、DB、ALP、γ-GT、ALT、AST）亦無明顯關聯(lián)（P>0.05）。
　　2.肝組織TSA-FISH結果顯示BA肝實質區(qū)m

9、iR-200a表達豐富，匯管區(qū)及纖維間隔則較低。BA組肝組織miR-200a熒光強度顯著高于正常組（11.92±2.18 vs4.33±1.26，t=7.82，P<0.01）。BA患兒中，低纖維化組miR-200a熒光強度則明顯低于高纖維化組（10.89±1.90 vs13.37±1.78，t=﹣2.29，P<0.05），亦即是肝纖維化程度越高，肝組織miR-200a表達越高，肝組織miR-200a與肝纖維化程度正相關（r=0.90，P

10、<0.05）；而輕度炎癥患兒與重度炎癥組miR-200a表達水平分別為11.54±2.70、12.45±1.25，兩組無統(tǒng)計學差異（t=﹣0.70，P>0.05），肝組織miR-200a與肝臟炎癥無明顯相關（r=0.41，P>0.05）。
　　3.與正常對照相較，BA患兒肝組織中ZEB1蛋白表達豐度顯著增高（2.40%vs0.16%， u=0.00， P<0.01），α-SMA蛋白亦明顯增高（12.19%±10.43% vs0.6

11、3%±0.23%，t=2.67，P<0.05），但E-cadherin蛋白則顯示為降低（9.54%±6.72%vs16.80%±6.16%，t=﹣2.22，P<0.05）。BA患兒中高纖維化組與低纖維化組比較，ZEB1蛋白顯著降低（0.74%vs3.62%，u=4.00，P<0.05），而α-SMA蛋白增高（23.73%vs3.93%，u=2.00，P<0.05），E-cadherin也明顯增高（15.17%vs3.80%， u=4.0

12、0，P<0.05）。相關分析結果表明，BA患兒肝組織miR-200a表達與ZEB1蛋白負相關（r=﹣0.83，P<0.01），并與E-cadherin蛋白正相關（r=0.59，P<0.05），但與α-SMA蛋白無明顯關聯(lián)（r=0.39，P>0.05）。
　　結論:
　　1. BA患兒循環(huán)miR-200a水平雖然不能直接預測肝纖維化程度，但可能與BA膽汁淤積引起的肝臟病理改變有關。
　　2. BA患兒肝組織miR-200