HMGA1基因沉默對神經(jīng)膠質(zhì)瘤放化療敏感性的影響.pdf

1、[背景與目的]
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是原發(fā)于顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，手術(shù)、放療和化療的綜合治療是其目前主要的治療手段。然而，由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性和特殊的解剖部位，手術(shù)難以完全切除，因此術(shù)后放療及化療就顯得尤為重要。近年來，盡管放化療進(jìn)展迅速，但其對神經(jīng)膠質(zhì)瘤療效并無顯著提高。目前研究結(jié)果提示:放化療的敏感性是限制其療效的一個重要因素。如何提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤放化療的敏感性，是目前亟需解決的問題。惡性腫瘤是一種基因異常導(dǎo)致的分子遺傳病，

2、通過分析正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間基因表達(dá)的差異，從中篩選出對腫瘤發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要作用的基因，進(jìn)而尋找具有潛在治療價(jià)值的靶點(diǎn)或途徑，有可能實(shí)現(xiàn)真正意義上的個體化綜合治療。高遷移率族蛋白組A1基因(high mobility group A1，HMGA1)在所有神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤內(nèi)均可檢測到HMGA1的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道，HMGA1基因不但影響肺癌的放射敏感性，而且也與肺癌的化療敏感性有關(guān)，其對神經(jīng)膠質(zhì)瘤放化療敏感性的影響研究較少。因此，本研

3、究以HMGA1為靶基因，采用RNA干擾技術(shù)，分別探討SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株HMGA1基因沉默后對吉西他濱化療敏感性的影響，探討U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株HMGA1基因沉默后對放射敏感性的影響，為膠質(zhì)瘤臨床治療尋找新的特異性靶點(diǎn)。
　　 [方法]
　　 1、HMGA1 siRNA慢病毒質(zhì)粒及陰性siRNA慢病毒質(zhì)粒（不針對人類基因任何序列的陰性RNA干擾慢病毒質(zhì)粒）分別轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞、U87細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HMGA1

4、 siRNA的細(xì)胞為陽性轉(zhuǎn)染組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不含HMGA1（陰性siRNA）的細(xì)胞為陰性轉(zhuǎn)染組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對照組;
　　 2、RT-PCR檢測HMGA1 mRNA的純度和完整性，Western blot法檢測HMGA1蛋白的表達(dá);
　　 3、MTT法檢測不同濃度吉西他濱(0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml)處理SHG-44細(xì)胞72h后的細(xì)胞存活情況，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢

5、測不同濃度吉西他濱(0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml)處理SHG-44細(xì)胞10d后對細(xì)胞增殖能力的影響，F(xiàn)CM檢測不同濃度吉西他濱（0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml）干預(yù)SHG-44細(xì)胞72h后的細(xì)胞凋亡率，分光光度法檢測不同濃度吉西他濱（0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml）干預(yù)SHG-44細(xì)胞72h后的Caspase3、Caspase8、Casp

6、ase9活性，Western blot檢測不同濃度吉西他濱（0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml）干預(yù)SHG-44細(xì)胞72h后p-Akt(Ser-473)和Akt蛋白表達(dá);
　　 4、采用6MV-X線分別單次照射U87細(xì)胞0 Gy、1 Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，12天后利用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，采用單靶多擊模型擬合細(xì)胞存活曲線，評價(jià)基因沉默后放射敏感性的變化;
　　 5、6MV-X線單次

7、量4Gy照射U87細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變，初步探討HMGA1基因沉默后對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87細(xì)胞放射敏感性影響的可能機(jī)制。
　　 [結(jié)果]
　　 1、慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能成功轉(zhuǎn)染SHG44細(xì)胞、U87細(xì)胞，并可明顯下調(diào)HMGA1 mRNA和HMGA1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，陰性轉(zhuǎn)染組和空白對照組對HMGA1 mRNA和HMGA1蛋白的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);<

8、br>　　 2、SHG-44細(xì)胞經(jīng)吉西他濱處理后，同一劑量下，陽性轉(zhuǎn)染組（除0.005μg/ml外）細(xì)胞生長抑制率、細(xì)胞凋亡率均顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)，克隆形成率顯著低于陰性轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)，且細(xì)胞生長抑制率、細(xì)胞凋亡率與吉西他濱劑量呈正相關(guān)，克隆形成率與吉西他濱劑量呈負(fù)相關(guān)，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 3、SHG-44細(xì)胞Caspase3、8、9活性檢測結(jié)果顯示:陽性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Caspas

9、e3、8、9活性均高于陰性轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)，并與劑量呈正相關(guān);陽性轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組在總的Akt蛋白表達(dá)水平上無明顯差異(P＞0.05)，但陽性轉(zhuǎn)染組的p-Akt蛋白表達(dá)水平較陰性轉(zhuǎn)染組顯著下降（P＜0.05），且p-Akt蛋白表達(dá)水平與吉西他濱劑量呈負(fù)相關(guān);
　　 4、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測U87細(xì)胞照射后細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示:陽性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞D0=3.530，Dq=2.016，SF2=0.736，陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞D0=4.460

10、，Dq=3.506，SF2=0.807，空白對照組細(xì)胞D0=4.219，Dq=4.743，SF2=0.823，陽性轉(zhuǎn)染組D0、 Dq和SF2較陰性轉(zhuǎn)染組和空白對照組細(xì)胞均降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，放射增敏比SERD0分別為1.263和1.195，陰性轉(zhuǎn)染組和空白對照組細(xì)胞D0、Dq和SF2比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05):
　　 5、照射后U87細(xì)胞凋亡分析顯示:陽性轉(zhuǎn)染組凋亡率（8.3±0.3）％顯著高于陰性轉(zhuǎn)染

11、組（3.5±0.4）％和空白對照組（3.7±0.5）％(P＜0.01)。細(xì)胞周期分析顯示陽性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞G/G1期比例和G2/M比例分別為（70.9±1.2）％和（13.6±1.5）％，較陰性轉(zhuǎn)染組G0/G1期比例（58.7±0.5）％、G2/M比例（8.6±1.7）％和空白對照組G/G1期比例（57.2±1.1）％、G2/M比例（9.3±1.4）％均顯著增高(P＜0.01)，S期比例則降低且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

12、　　 [結(jié)論]
　　 1、HMGA1 siRNA能夠特異性下調(diào)SHG-44細(xì)胞和U87細(xì)胞HMGA1的基因表達(dá);
　　 2、HMGA1基因表達(dá)下調(diào)后增加SHG-44細(xì)胞對吉西他濱的化療敏感性;在一定劑量范圍內(nèi)，HMGA1基因沉默后吉西他濱對SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的化療敏感性與吉西他濱劑量呈正相關(guān)，其增敏機(jī)制與p-Akt活性下降、caspase活性增加所介導(dǎo)的凋亡有關(guān);
　　 3、HMGA1基因沉默增強(qiáng)U8