小分子化合物調(diào)節(jié)多種細胞周期蛋白促進巨核細胞的多倍體化.pdf

1、目的:
　　血小板是人體血液中重要的有形成分之一，其在止血、傷口愈合及炎癥反應等生理和病理過程中起著至關重要的作用。同時臨床的許多相關疾病都可導致血小板的減少，其中血液系統(tǒng)疾病、癌癥放療及大劑量化療、嚴重感染、終末期肝腎疾病等所引起的血小板減少，自身難以恢復，嚴重危害患者的生命健康，這時必須反復預防和治療性輸注血小板。然而目前的血液成分供應卻遠遠達不到臨床所需。大量的研究表明體外利用干細胞制備血小板是一種可行的方式，這將為血小板的

2、臨床應用獲得更多的來源。在血小板的形成過程中，有許多因素影響血小板的增殖、分化、成熟、釋放等，其中巨核細胞多倍體化的過程對于最終血小板的釋放量有著重要的意義。研究提示，多種小分子化合物能通過對細胞骨架的調(diào)控促進巨核細胞多倍體化的形成。因此，我們的研究希望通過優(yōu)化小分子化合物的添加獲得更多多倍體的巨核細胞，為未來規(guī)?；难“逯苽涮峁┬虏呗院图夹g支持。
　　方法:
　　首先建立了白血病細胞系向巨核細胞分化的培養(yǎng)體系，使用低濃度

3、的佛波酯(PMA)對其進行誘導分化，并使用高濃度的PMA對其進行多倍體化的誘導;通過流式細胞技術檢測細胞表面標志及其細胞周期的變化，篩選出可獲得更多多倍體的誘導體系，并用于后續(xù)的研究。接下來分別將四種不同的小分子化合物尼克酰胺(NIC)、RHO-ROCK通路抑制劑(RRI)、Src通路抑制劑(SI)、Aurora-B通路抑制劑(ABI)單獨加入到細胞系誘導體系及臍帶血單個核細胞中，并再一步采用流式細胞技術檢測細胞周期的變化，并對巨核細胞

4、特異性表面標志進行檢測，同時通過CCK-8及其細胞凋亡檢測進一步分析細胞的增殖及凋亡情況，篩選出有利于細胞多倍體化，同時又不影響細胞凋亡的小分子化合物作為優(yōu)選的靶分子。進一步檢測不同組合的小分子對多倍體形成的影響，并篩選優(yōu)化出最佳的小分子組合。最終，使用Q-PCR及其Western Blot技術對優(yōu)選的小分子組合及促進白血病細胞系和造血祖細胞來源的巨核細胞多倍體化的機制進行深入探討。
　　結果:
　　在優(yōu)化細胞系的培養(yǎng)中，采

5、用PMA(0.625ng/ml)進行誘導分化3天，再采用PMA(10ng/ml)對細胞系進行多倍體化誘導9天所形成的多倍體量達到15％以上，并與其它兩種方式具有顯著統(tǒng)計學差異。使用不同的四種小分子化合物后，在細胞系及臍帶血單個核細胞中均顯示SI和ABI兩種小分子可以明顯的促進巨核細胞的多倍體化，并分別達到了29％以上，原代細胞中四倍體提高到14％，然而ABI對于原代細胞有明顯的促凋亡作用，凋亡比例達到了70％，而SI在不影響細胞凋亡的情

6、況下，促進多倍體的形成及特異性標志CD61的表達，SI是優(yōu)選的小分子化合物。進一步檢測其小分子組合的結果顯示，RRI+SI組合不僅可以提高細胞多倍體的形成，同時兩種小分子的加入促進了向巨核系分化的特異性表面標志的表達陽性率可提高54.65％，且不影響其細胞凋亡，從形態(tài)上也可以明顯地觀察到細胞多倍體。通過對組合小分子作用機制的探討，結果顯示SI和RRI可以降低p53及p21基因的表達，從而明顯地提高cyclin D1、cyclin E和c

7、yclin B1幾種細胞周期蛋白的表達，最終促進了多倍體的形成。
　　結論:
　　體外制備血小板是未來重要的血小板來源，目前的研究表明可以通過小分子化合物的應用促進多倍體的形成，通過比較之間對多倍體的促進作用并尋找更有效的小分子組合。從我們的實驗結果顯示，NIC促進多倍體的形成效果并不明顯，同樣的也發(fā)現(xiàn)ABI盡管促進多倍體化明顯，但是其凋亡作用使多倍體最終形成效率明顯的下降。我們的研究顯示RRI+SI的組合不管是加入到細胞系