hCdc14A調(diào)節(jié)細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)是一個有序的基因調(diào)控過程，需要各個細(xì)胞事件之間的密切協(xié)調(diào)。不能正常完成一個細(xì)胞周期的細(xì)胞將進(jìn)入程序化死亡或發(fā)生癌變。正確退出有絲分裂，完成胞漿分離之前必需確保已經(jīng)完成正確的染色體分離和紡錘體解聚。Cdc14(Cell division cycle gene 14，細(xì)胞分裂周期基因14) 蛋白是一種雙特異性絲/蘇氨酸磷酸酶，在MEN(Mitotic Exit Network)和FEAR(CdcFourteen Early A

2、naphase Release)兩個網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控下獲得激活，使一些重要的Cdk底物去磷酸化，從而使芽殖酵母細(xì)胞退出有絲分裂。哺乳動物細(xì)胞調(diào)控有絲分裂退出的機(jī)制目前還沒有闡明。人類存在著兩種Cdc14的同源物，分別稱為hCdc14A和hCdc14B。目前的研究表明它們和微管聚合、中心體復(fù)制、染色體分離、胞質(zhì)分裂等多個細(xì)胞事件均有關(guān)系。了解有絲分裂，闡明細(xì)胞周期需要進(jìn)一步明晰它們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本課題組擬用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選hCdc14A的相互作

3、用蛋白，并且深入研究1～2個有關(guān)基因和蛋白質(zhì)，闡明其與hCdc14A的相互關(guān)系和在細(xì)胞周期中的功能。 第一部分：酵母雙雜交篩選hCdc 14A的相互作用蛋白。 目的: 用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選hCdc14A的可能相互作用蛋白。 方法： 基本按Clontech公司提供的說明進(jìn)行：PCR得到hCdc14A基因全長，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-hCdc14A；測序驗(yàn)證讀碼框和接入片段的正確性；驗(yàn)證hCdc14

4、A是否有自激活報告基因的能力：Western-Blot驗(yàn)證hCdc14A在酵母中的表達(dá)；驗(yàn)證人testiscDNA文庫的酵母轉(zhuǎn)化效率；順序轉(zhuǎn)化hCdc14A和人testis cDNA文庫到酵母AH109細(xì)胞，然后在3缺培養(yǎng)基(缺色氨酸、亮氨酸、組氨酸)上挑取在該培養(yǎng)基上生長的克隆，轉(zhuǎn)四缺培養(yǎng)基(缺色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺氨酸)，利用x-α-gal檢測這些克隆是否表達(dá)LacZ報告基因；從陽性的酵母中提取文庫質(zhì)粒，與pGBKT7-hCdc

5、14A共轉(zhuǎn)AH109細(xì)胞驗(yàn)證蛋白間相互作用；測序得到陽性克隆質(zhì)粒基因序列；數(shù)據(jù)庫序列比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.)。 結(jié)論： 用酵母雙雜交系統(tǒng)共篩查出23個可能的hCdc14A相互作用蛋白，包括細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、泛素化相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白，為進(jìn)一步研究hCdc14A的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)打下了基礎(chǔ)。 第二部分：hCdc14A的磷酸酶活性受分子內(nèi)作用調(diào)控。 目的:

6、 剖析 hCdc14A 功能域片段和全長的細(xì)胞學(xué)特征和磷酸酶活性。 方法： PCR克隆hCdc14A基因全長和功能域各片段；將各段構(gòu)建到綠色熒光真核表達(dá)載體pEGFP-C2，利用熒光顯微鏡觀察各片段在Hela細(xì)胞周期中的定位，并且觀察各段過表達(dá)對細(xì)胞周期表型的影響；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；Pulldown試驗(yàn)和免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證各片段之間的相互作用；用MFP蛋白磷酸酶活性檢驗(yàn)試劑盒檢測磷酸酶活性。 結(jié)論：

7、 hCdc14A的C端可以抑制N端的磷酸酶活性，提示hCdc14A的磷酸酶活性受分子內(nèi)作用調(diào)控。 第三部分：Plk1磷酸化hCdc14A并且調(diào)節(jié)hCdc14A的磷酸酶活性。 目的: 探討hCdc14A與Plk1的相互作用和功能聯(lián)系。 方法： 構(gòu)建GFP-hCdc14A和FLAG-Plk1的表達(dá)載體，觀察hCdc14A與Plk1在Hela細(xì)胞中的定位情況；Pulldown和免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證相

8、互作用；熒光顯微鏡下觀察過表達(dá)Plk1、hCdc14A野生型，磷酸化和非磷酸化突變體對Hela細(xì)胞有絲分裂的影響；動態(tài)實(shí)時熒光顯微鏡下觀察各突變體對Hela細(xì)胞周期的影響；體外磷酸化試驗(yàn)驗(yàn)證Plk1對hCdc14A的磷酸化作用；MFP磷酸酶活性檢驗(yàn)試劑盒檢驗(yàn)hCdc14A磷酸化突變體的磷酸酶活性。 結(jié)論： Plk1可以磷酸化hCdc14A，并增強(qiáng)它的磷酸酶活性，此作用可能是釋放了C端對N端的磷酸酶活性抑制作用所致。