利用RNA干擾技術(shù)研究PARP1在氫醌細(xì)胞毒性及DNA甲基化過程中的作用.pdf

1、研究目的：本研究通過構(gòu)建PARP1基因的發(fā)卡樣siRNA(smallinterfereRNA)真核表達(dá)載體，利用siRNA載體來抑制PARP1基因的表達(dá)，從而探索PARP1蛋白在氫醌細(xì)胞毒作用以及DNA甲基化過程中的作用，為進(jìn)一步研究PARP1的功能奠定基礎(chǔ)。 1、材料與方法 1.1材料 1.1.1細(xì)胞人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)由廣州醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)，細(xì)胞以DMEM/10％FCS，37℃，5％CO2培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

2、 1.1.2菌株大腸桿菌DH5α菌株由本教研室保存。 1.1.3質(zhì)粒載體RNAi-ReadypSIREN-RetroVector購于美國Clontech公司，全長6.4kb，是一帶有BamHI和EcoRI兩酶切位點(diǎn)的線性載體；pEGFP-C1綠色熒光蛋白載體購于美國Clontech公司，全長4.7kb。 1.2方法 1.2.1發(fā)卡樣PARP1基因siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建根據(jù)GenBank提供的PARP

3、1基因cDNA序列，通過BD公司提供的軟件以及BLAST挑選長為19個(gè)堿基的特異性寡核苷酸序列(5'-ATCTTCTCAAGGCAGACAC-3')，合成其發(fā)卡樣兩端配對(duì)siRNA寡核苷酸鏈，同時(shí)合成互補(bǔ)鏈，分別在5'和3'端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。將上下鏈經(jīng)過變性、復(fù)性后形成雙鏈PARP1siRNA。采用DNA重組技術(shù)，將PARP1siRNA雙鏈定向克隆入U(xiǎn)6啟動(dòng)子指導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體RNAi-ReadypSIREN-

4、RetroQVector。轉(zhuǎn)化連接子，37℃培養(yǎng)過夜，長出的單個(gè)單菌落為轉(zhuǎn)化菌菌落。挑單菌落種于10mlLB(含60μg/ml氨芐青霉素)中，37℃搖菌過夜。收集細(xì)菌，按說明書操作小量快速抽提質(zhì)粒DNA，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。 1.2.2pEGFP-C1-PARP1siRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建選擇酶切位點(diǎn)，將包括U6啟動(dòng)子和siRNA序列的片段切下，并亞克隆至入CMV啟動(dòng)子指導(dǎo)的pEGFP-C1熒光蛋白表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化連接子

5、，37℃培養(yǎng)過夜，長出的單個(gè)單菌落為轉(zhuǎn)化菌菌落。挑單菌落種于10mlLB(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃搖菌過夜。收集細(xì)菌，按說明書操作小量快速抽提質(zhì)粒DNA，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。 1.2.3PARP1蛋白缺陷細(xì)胞建立HBE細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，穩(wěn)定傳代后用于本實(shí)驗(yàn)。90％融合的HBE細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染5μgpEGFP-C1-NegsiRNA、pEGFP-C1-PARPlsiRNA(LIPO

6、FECTIN法)，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染對(duì)照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h，換含800μg/lG418、10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，篩選10-14天，收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液PMSF，提取細(xì)胞全蛋白。取50μg細(xì)胞全蛋白，10％SDS2PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，1∶500鼠抗人PARP1單抗，Westernblotting檢測(cè)胞內(nèi)PARP1的蛋白水平。 1.2.4PARP1蛋白缺陷細(xì)胞生物學(xué)性狀研究通過觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、生長特性及細(xì)胞

7、周期等生物學(xué)特性，了解轉(zhuǎn)染細(xì)胞惡性程度情況。 1.2.5PARP1蛋白缺陷細(xì)胞對(duì)毒物作用的影響以PARP1蛋白缺陷細(xì)胞株為模型，用標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑氫醌(hydroquinone,HQ)染毒，從微核形成率及細(xì)胞周期等方面測(cè)定細(xì)胞遺傳毒性，以研究PARP1蛋白功能及其缺陷細(xì)胞對(duì)HQ細(xì)胞毒作用的影響。 1.2.6PARP1蛋白缺陷細(xì)胞對(duì)DNA甲基化的影響HQ作用PARP1蛋白缺陷細(xì)胞后，用甲基化特異性PCR檢測(cè)其中p16RASSF1

8、A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，從RNA及蛋白水平檢測(cè)p16RASSF1A的表達(dá)。2、結(jié)果2.1發(fā)卡樣PARP1基因siRNA設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建根據(jù)GenBank提供的PARP1基因cDNA序列，合成兩對(duì)發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸鏈，命名為P1，P2。通過分子克隆和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，成功構(gòu)建了發(fā)卡樣PARP1基因siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。同時(shí)構(gòu)建陰性siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 2.2pEGFP-C1-P1siRNA和pEGFP-C

9、1-P2siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建經(jīng)過亞克隆和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，成功獲得pEGFP-C1-P1siRNA和pEGFP-C1-P2-siRNA真核表達(dá)載體。同時(shí)構(gòu)建陰性siRNA熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-C1-NsiRNA。 2.3PARP1蛋白缺陷細(xì)胞建立對(duì)于三種質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HBE細(xì)胞48h后，在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)，正式轉(zhuǎn)染成功，分別命名為HBEP1，HBEP2和HBEN，G418篩選后，提取

10、細(xì)胞全蛋白，Westernblotting鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者的PARP1蛋白表達(dá)分別為92.4％，17.8％和95.2％。說明pEGFP-C1-P2-siRNA載體能夠明顯抑制HBE細(xì)胞的PARP1表達(dá)。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用該載體進(jìn)行研究，將相應(yīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名HBEP細(xì)胞。 2.4PARP1蛋白缺陷細(xì)胞生物學(xué)性狀研究 2.4.1細(xì)胞生長形態(tài)觀察轉(zhuǎn)染初期HBEN、HBEP細(xì)胞形態(tài)變化明顯，失去類圓形生長，細(xì)胞內(nèi)顆粒明顯增多

11、，細(xì)胞形態(tài)成不規(guī)則型，但隨著傳代培養(yǎng)時(shí)間的增加，3種細(xì)胞形態(tài)趨于一致。 2.4.2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化HBE細(xì)胞核膜清晰完整，核仁明顯，線粒體膜完整，嵴明顯；HBEN、HBEP細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞核縮小、變形，胞漿出現(xiàn)空泡，基質(zhì)不明顯，嵴消失。 2.4.3細(xì)胞生長曲線3種細(xì)胞生長曲線均呈“S”形；三者生長速度接近。表明PARP1蛋白缺陷對(duì)細(xì)胞增殖能力無明顯影響。 2.4.4細(xì)胞周期觀察三種細(xì)胞在G1、G2和S期的分布

12、無顯著性差異(P＞0.05)，提示載體對(duì)細(xì)胞周期影響不大。 2.5PARP1蛋白缺陷細(xì)胞對(duì)毒物作用的影響 2.5.1細(xì)胞存活率用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長抑制率分析，HQ對(duì)HBE和HBEP細(xì)胞的生長抑制作用在0～80μmol/L范圍內(nèi)與劑量正相關(guān)。 2.5.2HBE和HBEP細(xì)胞微核結(jié)果HBE、HBEN和HBEP細(xì)胞經(jīng)、HQ染毒后，各劑量組不同程度出現(xiàn)含微核的細(xì)胞，含微核的細(xì)胞中有一個(gè)或數(shù)個(gè)微核，與各自對(duì)照組比較，從2

13、0μmol/L的HQ劑量組開始HBE和HBEP細(xì)胞的微核率明顯增加(P＜0.05)。相關(guān)分析結(jié)果表明，兩種細(xì)胞的微核率與HQ劑量間存在量效關(guān)系。 2.5.3HBE和HBEP細(xì)胞染毒后細(xì)胞周期結(jié)果隨氫醌劑量增加，兩組細(xì)胞均出現(xiàn)G2期阻滯，以HBEP更為明顯。同時(shí)，對(duì)于HBEP還表現(xiàn)S期阻滯，但HBE細(xì)胞沒有S期阻滯。 2.5.4HBE和HBEP細(xì)胞的彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果各劑量HQ處理后，兩種細(xì)胞的彗星實(shí)驗(yàn)存在差別。其中HBE細(xì)胞表

14、現(xiàn)出DNA損害率與HQ劑量正相關(guān)。HBEP細(xì)胞在20-100μMHQ處理后，DNA損害率大于HBE，但當(dāng)HQ劑量增加到160μM時(shí)，HBE的DNA損害程度比HBEP細(xì)胞嚴(yán)重。 2.6PARP1缺陷與DNA甲基化關(guān)系 2.6.1DNMT1的mRNA及蛋白表達(dá)：在HQ處理后的HBEP細(xì)胞中，DNMT1的表達(dá)增加，其RNA水平在染毒后第三天開始見到明顯上升(2.5)，第5天達(dá)到高峰(5.8)。相應(yīng)DNMT1的蛋白表達(dá)水平也增加

15、。而在HQ處理HBE細(xì)胞則DNMT1表達(dá)無明顯變化。 2.6.2p16和RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)檢測(cè)經(jīng)過HQ處理和未經(jīng)HQ處理的HBEP細(xì)胞，其p16和RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域的MSP檢測(cè)，都出現(xiàn)具有甲基化與未甲基化兩種條帶，而HBE細(xì)胞無論HQ處理與否，均只有未甲基化條帶。 2.6.3p16和RASSF1A的mRNA表達(dá)檢測(cè)對(duì)HBEP細(xì)胞進(jìn)行p16和RASSF1ART-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)mRNA表達(dá)

16、降低，而在在5-Aza-CdR處理后，則上調(diào)。 3、結(jié)論：成功利用RNA干擾技術(shù)抑制PARP1基因表達(dá)，為研究PARP1基因的功能打下基礎(chǔ)。 在正常生長環(huán)境下，PARP1蛋白缺陷對(duì)細(xì)胞生長形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、生長速度以及細(xì)胞周期有輕微的影響。 PARP1參與了細(xì)胞HQ所致毒性的應(yīng)答。且具有雙相性，既在中低劑量HQ作用下，PARP1的作用促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，在高劑量HQ作用下，由于PARP1過度激活，促進(jìn)細(xì)胞死亡。