番荔枝內(nèi)酯(ACGs)通過Notch1信號(hào)通路抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖及其機(jī)制初探.pdf

1、NOTCH信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，在機(jī)體發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。越來越多的研究表明:Notch信號(hào)通路在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中扮演重要角色，但其發(fā)揮致癌或抑癌作用通常依賴于所處的細(xì)胞環(huán)境?？谇击[狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)是最常見的人類惡性腫瘤之一，約占頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC)的9

2、0％以上，其致病機(jī)理還不清楚。最新完成的HNSCC大型隊(duì)列的全基因組研究表明人Notch1基因發(fā)生高頻突變，提示Notch1基因與OSCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。番荔枝內(nèi)酯（Annonaceous acetogenins，ACGs）是從番荔枝科植物中提取的一類長鏈脂肪酸內(nèi)酯化合物，對人白血病細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞等有很強(qiáng)的抑制作用，具有強(qiáng)效抗腫瘤活性和能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等特性，使其成為國內(nèi)外抗腫瘤藥研究熱點(diǎn)。但其對OSCC的作用和分子機(jī)制仍不明確。<

3、br>　　目的:
　　1.分析人Notch1基因在OSCC組織樣本和細(xì)胞中的基因變異和表達(dá)差異。
　　2.探討ACGs對OSCC細(xì)胞的增殖、凋亡的影響及這些影響是否通過Notch1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn);在此基礎(chǔ)上，上調(diào)或下調(diào)Notch1信號(hào)后，分析ACGs對OSCC細(xì)胞增值的影響，為OSCC防治提供研究基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.通過TCGA和USCS數(shù)據(jù)庫分析人Notch1基因在OSCC中的突變、表達(dá)差異和5年病人生存

4、率。
　　2.從5例OSCC及其癌旁組織中提取RNA，用qRT-PCR檢測人Notch1基因的表達(dá)水平;通過17例OSCC及其癌旁組織的石蠟切片完成免疫組化，分析Notch1基因的表達(dá)差異。分別提取正?？谇簧掀ぜ?xì)胞和OSCC細(xì)胞的RNA和蛋白，qRT-PCR及Western blot檢測上述兩類細(xì)胞系中Notch1及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　3.通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測ACGs對OSCC細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞技術(shù)檢測ACGs對OS

5、CC細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)分析ACGs作用OSCC細(xì)胞后Notch1蛋白及其轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ和下游目標(biāo)蛋白Hes1的表達(dá)。
　　4.采用過表達(dá)Notch1胞內(nèi)段(N1ICD)和DAPT抑制Notch1信號(hào)通路，進(jìn)一步驗(yàn)證ACGs通過Notch1信號(hào)通路影響OSCC細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)果:
　　1.TCGA和USCS數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示:人Notch1基因在HNSCC突變率高達(dá)20％，生存分析結(jié)果顯示Notch1表達(dá)較高

6、的病人5年生存期較長，值得關(guān)注的是大部分病人的癌組織中RBP-Jκ的表達(dá)高于癌旁組織。
　　2.qRT-PCR結(jié)果表明:在5例OSCC病人中3個(gè)病人Notch1表達(dá)水平高于其配對的癌旁組織;免疫組化結(jié)果表明:17例OSCC切片中有11例病人癌組織的Notch1呈陽性，且其中部分病人癌組織分裂期細(xì)胞染色較深，顯示強(qiáng)陽性結(jié)果;qRT-PCR及Western blot結(jié)果也顯示3種OSCC細(xì)胞系中Notch1的表達(dá)均高于正?？谇簧掀ぜ?xì)胞

7、NOK。
　　3.MTT實(shí)驗(yàn)檢測ACGs對OSCC細(xì)胞系SCC15和SCC25增殖的影響，結(jié)果表明:ACGs對SCC15和SCC25的增殖均有抑制作用，且隨著ACGs劑量的升高，細(xì)胞凋亡數(shù)也增加，呈劑量依賴性。
　　4.通過AnnexinⅤ-FITC/PI染色和流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)ACGs誘導(dǎo)SCC15和SCC25細(xì)胞發(fā)生凋亡，特別是發(fā)現(xiàn)SCC15發(fā)生晚期凋亡。
　　5.Western blot結(jié)果表明:在ACGs作用下，

8、SCC15細(xì)胞中Notch1、RBP-Jκ和Hes1的表達(dá)均隨著劑量增加而減少，具有劑量依賴性。
　　6.成功構(gòu)建Notch1胞內(nèi)段N1ICD真核表達(dá)質(zhì)粒并在SCC15細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。同未轉(zhuǎn)染N1ICD的SCC15細(xì)胞相比，在ACGs作用下，過表達(dá)N1ICD的SCC15細(xì)胞的增殖明顯;同未轉(zhuǎn)染N1ICD的SCC15細(xì)胞相比，在ACGs和DAPT的共同作用下，過表達(dá)N1ICD的SCC15細(xì)胞的增殖能力被明顯抑制。
　　結(jié)論:

9、
　　1.人Notch1基因在OSCC中是高頻突變基因，其表達(dá)水平同OSCC的5年生存時(shí)間有關(guān);進(jìn)一步研究顯示人Notch1基因在OSCC組織和細(xì)胞水平上有較高的表達(dá)，表明人Notch1基因可能與OSCC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　2.ACGs對OSCC細(xì)胞生長增殖有抑制作用，能抑制OSCC細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死，ACGs作用于OSCC細(xì)胞后，Notch1及RBP-Jκ和Hes1的表達(dá)下降。上調(diào)和抑制Notch1信號(hào)