MiR-218-5p通過CD44-ROCK通路抑制口腔鱗癌細胞侵襲.pdf

1、口腔鱗狀細胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，在我國 OSCC的發(fā)病率約在3.6/10萬-8.0/10萬人之間。OSCC具有較早的淋巴結轉移的傾向，晚期可轉移至肺、肝、骨等器官，其五年生存率為50%左右。研究認為發(fā)生轉移的腫瘤細胞常位于侵襲前沿（Invasive front），與位于腫瘤主體的細胞相比，侵襲前沿的細胞具有更強的侵襲能力，許多導致腫瘤侵襲的分子事件比如蛋白

2、水解酶的分泌、細胞增殖活性的增加、血管新生、細胞間黏附分子的改變等均在侵襲前沿被發(fā)現。因此，辨別并篩選出侵襲前沿細胞亞群可以使我們更深入地解析腫瘤侵襲和轉移的分子機制，發(fā)現抑制腫瘤轉移的新靶點。在 OSCC侵襲前沿研究方面，以往研究多局限于利用免疫組織化學染色方法分析侵襲前沿細胞上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）標志物的表達，難以分離獲得這些位于侵襲前沿的癌細胞，無法對其進行深入的

3、分析。因此，在體外模擬 OSCC組織在體內的侵襲狀況，分離獲得侵襲前沿的癌細胞是解決這一問題的有效途徑。微流控芯片是一種在微米尺度的空間對流體進行操控為主要特征的科學技術，與傳統(tǒng)技術相比較微流控技術是對哺乳動物細胞及其微環(huán)境進行操控的理想平臺，它消耗低、通量高、仿生性強，在一定程度上可以取代動物模型。本研究以微流控芯片為平臺分離獲得了侵襲前沿的OSCC細胞，并深入分析了促進 OSCC細胞侵襲性增強的分子機制。遺傳和表觀遺傳因素均可調控腫

4、瘤細胞的侵襲性，最近研究發(fā)現微小RNA（microRNA，miRNA）可以在表觀遺傳水平調控腫瘤侵襲。然而，miRNA在OSCC侵襲前沿細胞的表達狀況及其促進侵襲的機制目前尚未完全闡明。我們對在微流控芯片上分離獲得的OSCC侵襲前沿細胞進行small RNA測序，揭示了miRNA在侵襲前沿細胞的表達特點，并探究了其調控分子信號通路，為闡明 OSCC的侵襲機制提供一種新的視點。
　　目的：
　　以微流控芯片為平臺分離獲得 OS

5、CC侵襲前沿細胞，從表觀遺傳水平探討OSCC侵襲性增強的分子機制。
　　方法：
　　本研究采用的OSCC細胞株為UM-SCC6，采用本實驗室構建的微流控芯片及其操作方法分離獲得UM-SCC6侵襲前沿細胞。具體操作如下：在微流控芯片上利用基質膠通道分隔細胞培養(yǎng)通道和刺激誘導通道，將UM-SCC6接種在細胞培養(yǎng)通道，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在刺激誘導通道加入20%血清的細胞培養(yǎng)液，誘導UM-SCC6細胞的侵襲，將侵襲通過基質膠通道

6、遷移至刺激誘導通道的細胞采用胰蛋白酶消化后，移到培養(yǎng)皿中擴大培養(yǎng)。上述誘導步驟連續(xù)重復3次，最終獲得UM-SCC6侵襲前沿細胞。采用劃痕實驗考察細胞遷移能力；采用微流控芯片和Transwell小室考察細胞侵襲能力；采用細胞免疫熒光染色和Western blot檢測EMT經典標志物的表達，如E-鈣粘蛋白（Epithelial cadherin，E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin，Vim）和神經鈣粘蛋白（Neural cad

7、herin，N-cadherin）；CCK8增殖實驗考察細胞的增殖能力。
　　采用Trizol法提取UM-SCC6-M和UM-SCC6的總RNA，送至Novogene公司進行測序建庫和質量控制，進行small RNA測序分析。在對獲得的數據質量進行基本分析后，對比 UM-SCC6和 UM-SCC6-M的差異表達 miRNAs，通過miRanda對獲得的miRNAs的靶基因進行預測，并行 KEGG富集分析。采用realtime PC

8、R分析miRNA的表達；采用western blot檢測蛋白表達；利用mimic和inhibitor的轉染研究miRNA的功能，利用Western blot和熒光素酶報告系統(tǒng)確定miRNA對CD44的調控作用和直接結合。利用ROCK蛋白的抑制劑Y27632來檢測miR-218-5p對細胞侵襲的調控作用與CD44-ROCK通路的關系。
　　結果：
　　基于微流控芯片的細胞培養(yǎng)、誘導、分離，我們獲得了UM-SCC6侵襲前沿細胞，

9、命名為UM-SCC6-M。不同于UM-SCC6的“鋪路石”樣，UM-SCC-M細胞之間連接較為松散，部分細胞形態(tài)呈類似成纖維細胞的細長形，有的具有長長的“偽足”，有的細胞呈“多角形”，形態(tài)學上UM-SCC6-M具有間質細胞的特點。劃痕實驗顯示UM-SCC6-M具有比UM-SCC6強的遷移能力。在侵襲前沿微流控芯片體外模型中，經過24、48、72和96小時的血清誘導，UM-SCC6-M侵襲入基質膠中的高度和面積比 UM-SCC6顯著增加。

10、Transwell侵襲實驗顯示UM-SCC6-M侵襲過Matrigel膠膜的細胞數目明顯增多。免疫熒光染色和Western blot表明 E-cadherin蛋白水平在 UM-SCC6-M顯著降低，而 Vim和 N-cadherin則顯著增高。CCK8增殖實驗顯示UM-SCC6-M的增殖能力與UM-SCC6相比較沒有顯著變化。因此，我們分離獲得了OSCC侵襲前沿細胞UM-SCC6-M，并證明其具有間質細胞的特點和較強的侵襲能力。

11、　　通過small RNA測序及分析，我們獲得了44個UM-SCC6和UM-SCC6-M表達差異的miRNA，其中27個在 UM-SCC6-M中表達降低。我們對 miRNAs靶基因的富集通路進行KEGG富集，發(fā)現這些miRNA調控許多腫瘤相關信號通路，最為顯著的是癌癥蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）信號通路。因此，我們將研究重點放到了影響腫瘤轉移的CD44信號通路。
　　Realtime PCR實驗結果顯

12、示CD44的mRNA在UM-SCC6-M中的表達水平與UM-SCC6相似，western blot結果顯示CD44蛋白在UM-SCC6-M中的表達水平高于UM-SCC6，提示miRNA可能調控了CD44在UM-SCC6-M中的表達。Small RNA測序結果顯示miR-218-5p在UM-SCC6-M的表達水平下降，realtime PCR實驗結果與測序結果一致。通過miRanda預測網站預測miR-218-5p在CD44的mRNA上有

13、結合位點，熒光素酶報告系統(tǒng)實驗確認了miR-218-5p對CD44的mRNA的3’UTR區(qū)域的直接結合和調控作用，提示miR-218-5p調控的CD44表達可能在 OSCC侵襲中發(fā)揮一定的作用。我們采用miR-218-5p的mimic和inhibitor干擾miR-218-5p的表達水平，Western blot顯示miR-218-5p的mimic和inhibitor可以影響CD44蛋白的表達，基于微流控芯片和Transwell的侵襲實

14、驗均顯示 miR-218-5p的mimic顯著抑制 UM-SCC6-M的侵襲，而 miR-218-5p的inhibitor則顯著促進UM-SCC6的侵襲能力，同時miR-218-5p的inhibitor的促侵襲作用可被CD44下游蛋白ROCK的inhibitor逆轉，證明了miR-218-5p可以調控CD44-ROCK信號通路。
　　結論：
　　我們發(fā)展了一種基于微流控芯片分離 OSCC侵襲前沿細胞的方法，分離獲得了具有部分