microRNa-188作用于靶基因SIX1負(fù)調(diào)控ERK信號通路抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖侵襲.pdf

1、目的：摸索SIX1、miR-188在口腔鱗癌組織細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)及其所能具有的能力。分析SIX1在口腔鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮其作用所依賴的信號通路以及miR-188在口腔鱗癌細(xì)胞中的潛在分子機制。
　　方法：原發(fā)性腫瘤樣本、口腔鱗癌新鮮組織以及相對應(yīng)的臨近的健康組織進行免疫組織化學(xué);細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染;實時熒光定量PCR;Western blot;集落形成實驗;MTT實驗;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期;基質(zhì)膠侵襲實驗;熒光素報告實驗。
　　

2、結(jié)果：1.SIX1在口腔鱗癌中的表達:正常的口腔上皮細(xì)胞里是沒有SIX1表達陽性染色的。在80例的口腔鱗癌病理樣本里有32例的SIX1呈現(xiàn)細(xì)胞核和細(xì)胞漿陽性反應(yīng)。2.SIX1對于口腔鱗癌的臨床意義:SIX1的過度表達同較高的TNM分級，瘤體不同時期以及是否有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。3.SIX1促進口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲:Detroit562細(xì)胞系內(nèi)源增殖數(shù)量偏大，KB細(xì)胞系內(nèi)源增殖數(shù)量偏小。SIX1轉(zhuǎn)染后能夠顯著上調(diào)SIX1信使RNA以

3、及相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達量，siRNA基因干擾則能起到相反的作用。MTT發(fā)現(xiàn)SIX1轉(zhuǎn)染能夠增強KB細(xì)胞系的增殖能力，經(jīng)過siRNA處理的Detroit562細(xì)胞系則阻礙細(xì)胞增殖。transwell實驗證明了，SIX1干擾后細(xì)胞的增殖浸潤弱化而SIX1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖浸潤顯著增強。4.SIX1調(diào)控cyclin D1以及MMP-2:SIX1轉(zhuǎn)染能夠顯著提高cyclin D1以及MMP-2蛋白合成，SIX1干擾則抑制了這些蛋白的合成。5.SIX1

4、通過ERK信號通路調(diào)控MMP-2:SIX1過表達能夠明顯提高ERK的磷酸化能力，相反對于JNK和p38的磷酸化能力不產(chǎn)生改變。6.SIX1調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化:SIX1過度表達能夠降低KB細(xì)胞群內(nèi)E-cadherin的含量水平，相反SIX1干擾會略提高E-cadherin的含量水平。同時SIX1對Snail和Twist蛋白質(zhì)的表達還具有正向調(diào)控作用。7.miR-188在口腔鱗癌細(xì)胞中表達下調(diào):口腔鱗癌病理組織內(nèi)miR-188的含量顯著下調(diào)。

5、口腔鱗癌病理組織細(xì)胞中miR-188含量較相應(yīng)的健康部分為少，比值為0.457。8.miR-188在體外細(xì)胞系中的表達:Detroit562細(xì)胞群內(nèi)miR-188的含量并不高，而FaDu細(xì)胞群內(nèi)miR-188的含量略高。miR-188 mimic轉(zhuǎn)染能夠顯著上調(diào)Detroit562細(xì)胞系中miR-188的表達量;但是miR-188抑制劑能夠顯著下調(diào)FaDu細(xì)胞系中miR-188的含量。9.miR-188在體外能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖和侵襲:m

6、iR-188 mimic轉(zhuǎn)染后Detroit562細(xì)胞系集落形成數(shù)目顯著降低，miR-188抑制劑轉(zhuǎn)染后FaDu細(xì)胞系集落形成數(shù)目顯著增加?；|(zhì)膠侵襲實驗中Detroit562細(xì)胞系中外源性miR-188含量增加，穿過基底膠的細(xì)胞總量明顯降低。miR-188抑制劑轉(zhuǎn)染FaDu細(xì)胞系，穿過基質(zhì)膠到達上層的細(xì)胞數(shù)目明顯增加。10.miR-188在體外能夠調(diào)控細(xì)胞周期進程:經(jīng)過miR-188 mimic轉(zhuǎn)染后能夠抑制細(xì)胞由G1向S轉(zhuǎn)變，經(jīng)過m

7、iR-188抑制劑處理的細(xì)胞系能夠促進細(xì)胞周期進程的轉(zhuǎn)變。11.miR-188上調(diào)cyclin D1，cyclin E和MMP9蛋白的表達量:經(jīng)過miR-188 mimic轉(zhuǎn)染后能夠顯著下調(diào)cyclin D1，cyclin E和MMP9的表達量，miR-188抑制劑轉(zhuǎn)染能夠明顯上調(diào)以上蛋白質(zhì)的表達量。12.miR-188負(fù)調(diào)控致癌基因SIX1:Detroit562細(xì)胞系轉(zhuǎn)染后，miR-188的過量表達能夠顯著減少SIX1信使RNA的表達

8、量。13.SIX1為miR-188作用的直接靶基因:載有野生型SIX1基因的Detroit562細(xì)胞系，經(jīng)過miR-188mimic的轉(zhuǎn)染之后，熒光含量測定呈現(xiàn)降低的趨勢，而載有突變型SIX1基因的Detroit562細(xì)胞系中熒光強度則沒有明顯變化。表明SIX1基因的3'端非編碼區(qū)域是miR-188的直接結(jié)合位點，并通過這樣的結(jié)合下調(diào)SIX1信使RNA的表達量。miR-188與SIX1信使RNA表達量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。SIX1基因干擾后發(fā)現(xiàn):

9、SIX1能夠消除siRNA SIX1對于cyclin D1以及MMP9蛋白質(zhì)表達下調(diào)的影響。在SIX1基因沉默的FaDu細(xì)胞系中，使用miR-188抑制劑也未能上調(diào)cyclin D1以及MMP9蛋白質(zhì)的表達量。
　　結(jié)論：1.SIX1于人類口腔鱗癌病理組織中呈過量表達。2.SIX1的過表達對于腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤有促進作用。3.SIX1促進腫瘤細(xì)胞增殖和浸潤的作用機制為ERK-MMP-2信號傳導(dǎo)以及上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化(EMT)。4.m