三子固本顆粒的制備及對糖尿腎病大鼠作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）作為一種日益增加的世界范圍性的流行性疾病，是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，并且最終會導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renaldisease，ESRD)。因此，深入研究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制與治療，已經(jīng)成為目前國內(nèi)外研究的熱點。三子固本顆粒（Sanziguben Granule，SZBG）由金櫻子、余甘子、五味子、絞股藍(lán)等四味中藥組成，是臨床用于治療糖尿病腎病、

2、保護(hù)藥物腎損傷的經(jīng)驗處方。因此，本文旨在三子固本顆粒的制備及其對實驗性糖尿病腎病大鼠保護(hù)作用機(jī)制的研究。
　　方法:
　　1、三子固本顆粒制備工藝研究
　　采用正交試驗設(shè)計方法，以總多糖含量和五味子醇甲含量作為綜合評價指標(biāo)優(yōu)化提取工藝;通過以吸濕性、溶解性和成型性作為評價指標(biāo)，對常用的輔料糊精、甘露醇、可溶性淀粉和乳糖四種輔料進(jìn)行篩選;通過比較顆粒的顏色均勻度和黏性大小，確定輔料的用量大小;通過以吸濕性、溶解性和成型性

3、作為評價指標(biāo)，確定輔料糊精與甘露醇兩種輔料之間的用量比例。
　　2、三子固本顆粒指紋圖譜的研究
　　通過對流動相、檢測波長、流速三個因素進(jìn)行篩選確定色譜條件;運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進(jìn)行圖譜分析，建立三子固本顆粒HPLC指紋圖譜。
　　3、三子固本顆粒血清藥物化學(xué)的研究
　　采用血清藥物化學(xué)方法，結(jié)合UPLC/Q-TOF-MS/MS追蹤中藥復(fù)方三子固本顆粒的入血成分。雄性SD大鼠，灌胃給予三子固本顆粒溶

4、液（9.6g/kg）并記錄灌胃給藥時間。大鼠分別于灌胃給藥前和灌胃給藥后的0.5h、1h、2h和4h的五個時間點從大鼠眼眶后靜脈血管叢取血約500μL作為空白血樣和含藥血樣，室溫靜置，離心，分離血清。分別對空白血清和含藥血清進(jìn)行除蛋白、濃縮、復(fù)溶處理，于UPLC-Q-TOF-MS/MS進(jìn)樣分析。
　　4、三子固本顆粒有效成分含量的測定研究
　　通過紫外分光光度計法測定15批三子固本顆粒中總多糖的含量，通過HPLC法分別測定1

5、5批三子固本顆粒中沒食子酸和柯里拉京的含量;并對方法學(xué)的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率進(jìn)行考察。
　　5、三子固本顆粒對實驗性糖尿病腎病大鼠保護(hù)作用機(jī)制的研究
　　采用單側(cè)摘腎加腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)的方法復(fù)制實驗性糖尿病腎病大鼠。用三子固本顆粒、福辛普利灌胃給藥大鼠，觀察三子固本顆粒對實驗性糖尿病腎病大鼠的一般情況的影響，并分別于藥物治療的2、4、6、8、10、12周末，測定大鼠的血糖和

6、24h尿蛋白。連續(xù)灌胃給藥12周后，收集大鼠血清、腎臟組織。通過測定大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）作為指標(biāo)評價大鼠腎功能水平;通過測定大鼠甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)作為指標(biāo)評價大鼠血脂水平;通過測定大鼠血清丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)作為指標(biāo)評價大鼠氧化應(yīng)激水平。大鼠腎臟組織進(jìn)行HE染色、PAS染色和Masson染色觀察腎臟病理損傷;Western blotting檢測大鼠腎臟4-HNE、

7、Nrf2、HO-1、NQO1、Cleaved caspase-3、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin以及α-SMA蛋白表達(dá)情況，研究三子固本顆粒保護(hù)實驗性糖尿病腎病大鼠的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、確定三子固本顆粒的制備工藝為:先按處方量分別稱取金櫻子、絞股藍(lán)、五味子和余甘子四種中藥材，用12倍量的水提取3次，每次1h，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.30左右的稠膏，然后加入2倍稠膏量的輔料

8、（糊精∶甘露醇=1∶1.5），制備軟材，過篩制成顆粒，干燥，整粒，分裝即得。
　　2、建立三子固本顆粒HPLC指紋圖譜，標(biāo)示了18個共有峰，并對其中4個共有峰進(jìn)行成分確認(rèn)，15批三子固本顆粒樣品的相似度均在0.93以上。
　　3、采用血清藥物化學(xué)方法，結(jié)合UPLC/Q-TOF-MS/MS追蹤中藥復(fù)方三子固本顆粒的入血成分分別是沒食子酸和柯里拉京。
　　4、紫外分光光度計法總多糖含量測定:線性范圍為1.9168μg/mL

9、-14.3760μg/mL(R2=0.9988)，平均回收率98.81％(RSD=2.7％，n=6)，15批樣品總多糖平均含量為112.8mg/g;HPLC法沒食子酸含量測定:線性范圍為4.94μg/mL-79.0μg/mL(R2=0.9996)，平均回收率97.87％(RSD=2.9％，n=6)，15批樣品沒食子酸平均含量為7.08mg/g;HPLC法柯里拉京含量測定:線性范圍為26.0μg/mL-459.0μg/mL(R2=0.99

10、99)，平均回收率98.94％(RSD=3.07％，n=6)，15批樣品柯里拉京平均含量為2.15mg/g。
　　5、給藥0至12周，與DN組比較，三子固本顆粒對于實驗性糖尿病腎病大鼠的血糖并沒有明顯的降低作用，而對實驗性糖尿病腎病大鼠24h尿蛋白有明顯的降低作用。連續(xù)給藥12周后，實驗性糖尿病腎病大鼠血脂和腎功能明顯得到改善，另三子固本顆粒通過降低血清中MDA水平、升高CAT、GSH活性，以提升機(jī)體的抗氧化能力，改善實驗性DN大

11、鼠氧化性損傷。同時，三子固本顆粒通過上調(diào)Nrf2、HO-1、Bcl-2、E-cadherin蛋白表達(dá)，下調(diào)NQO1、Cleaved caspase3、Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)，提示三子固本顆粒可能是通過降低大鼠腎臟氧化應(yīng)激、抑制凋亡和EMT作用，達(dá)到保護(hù)實驗性糖尿病腎病大鼠的作用。
　　結(jié)論:
　　通過正交試驗設(shè)計方法確定三子固本顆粒的制備工藝，并成功建立三子固本顆粒的指紋圖譜;采用血清藥物化學(xué)方法，結(jié)合UPLC