落新婦苷通過上調(diào)PPARα-γ對大鼠糖尿病腎病的保護作用及機制探討.pdf

1、隨著我國經(jīng)濟物質(zhì)水平的提高，2型糖尿病的發(fā)病率逐年上升，作為糖尿病微血管并發(fā)癥的之一—糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)其發(fā)病率也逐年升高，在我國也是導(dǎo)致終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)的第二大病因。DKD早期特征性表現(xiàn)為微量白蛋白尿，繼而出現(xiàn)持續(xù)性白蛋白尿排泄率增高、水腫、高血壓、進行性腎功能不全，最終發(fā)展至ESRD。糖尿病腎臟病病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extra

2、cellular matrixc，ECM)成分在腎小球系膜和腎小管間質(zhì)進行性沉積，最終發(fā)展為不可逆的腎臟纖維化。另外，體內(nèi)環(huán)境紊亂如高血脂、高血糖、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin angiotensin aldosteronesystem，RAAS)激活等多種因素導(dǎo)致腎臟系膜細(xì)胞損傷，釋放諸如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein1，MCP-1）等多種炎癥因子。這些炎癥因子可以通過激活核

3、巨噬細(xì)胞聚集，加重ECM沉積;也可以通過刺激轉(zhuǎn)化生長因子-β、結(jié)締組織生長因子等多種生長因子的表達(dá)，引起纖維蛋白原、膠原蛋白Ⅳ等多種膠原代謝失衡，ECM積聚，導(dǎo)致腎臟纖維化。近年來眾多學(xué)者從分子水平對DKD的發(fā)病及進展進行研究，發(fā)現(xiàn)多條信號通路如AMPK(Adenosine5'-monophosphate-activated protein kinase)、JNK(c-JunN-terminal kinase)等以及氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

4、水平的異常介導(dǎo)DKD的發(fā)生發(fā)展，但DKD的機制尚未完全明了，目前也缺乏針對糖尿病腎臟病進展行之有效的治療方法。
　　腎小球系膜病變是糖尿病腎臟病最突出的病理改變之一，系膜細(xì)胞是位于腎小球內(nèi)主要的固有細(xì)胞，其細(xì)胞核較小、形態(tài)不規(guī)則，有突起可伸入內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜之間，亦可經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞間隙突入毛細(xì)血管腔內(nèi)。系膜細(xì)胞可通過形態(tài)改變調(diào)節(jié)毛細(xì)血管管徑大小影響其血流量大小。系膜細(xì)胞也可以通過分泌腎素和多種酶類物質(zhì)，局部調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)血流量。系膜細(xì)胞

5、發(fā)生表型改變，由正常表型轉(zhuǎn)化為具有增殖或分泌表型可能是ECM合成增加的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。α-SMA在正常的成熟系膜細(xì)胞幾乎不表達(dá)，但在長期高糖刺激下可重新表達(dá)，其表達(dá)再現(xiàn)是系膜細(xì)胞表型改變的標(biāo)志物。系膜細(xì)胞表型改變是糖尿病腎臟病進展和慢性腎臟纖維化的重要原因，其主要表現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞肥大、α-SMA的異常表達(dá)、ECM大量分泌等。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)表達(dá)與系膜細(xì)胞表型改變密切相關(guān)，

6、其MMPs表達(dá)降低與ECM堆積密切相關(guān)，最終加重腎小球纖維化。
　　過氧化物酶體增值體激活受體（PeroxisomeProliferator Activated Receptors，PPARs是核激素活化的受體和轉(zhuǎn)錄因子，目前已發(fā)現(xiàn)其有三個亞型:PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ。一系列的研究表明，PPARs在調(diào)節(jié)脂類代謝、胰島素敏感性，免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長和分化中都起了重要作用，PPARs還參與代謝綜合征:如胰島素抵抗，高血

7、脂、高血壓、動脈粥樣硬化、微量白蛋白尿。PPARγ是一類配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子，屬于激素核受體超家族。它在脂肪組織中高表達(dá)，在調(diào)節(jié)脂類代謝、胰島素敏感性、炎癥及免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)及細(xì)胞生長和分化中都起了重要作用?？固悄虿∷幬镆葝u素增敏劑四氫噻唑烷二酮類藥物(Thiazolidinedione，TZD)，如羅格列酮和曲格列酮，是PPAR-γ特異性配體。TZD與PPAR-γ結(jié)合后，調(diào)控與胰島素效應(yīng)有關(guān)多種基因的轉(zhuǎn)錄。越來越多的臨床及

8、循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，TZD類對保護糖尿病腎臟病及非糖尿病性腎病患者的腎功能有著很大的益處，但其機制仍不十分明確。
　　PPAR-α主要分布在一些脂肪分解代謝活躍的器官或組織（如肝、心、脂肪組織、骨骼肌、血管內(nèi)皮細(xì)胞、動脈粥樣斑塊等），是脂肪酸氧化酶基因必要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)節(jié)脂類的攝取及氧化，調(diào)節(jié)氨基酸的代謝，且參與止血、脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、冠心病和動脈粥樣硬化等疾病的病理生理過程。研究顯示，過多的膽固醇、三酰甘油等脂質(zhì)在腎臟異位

9、沉積與DKD發(fā)生及腎小球硬化有關(guān)[1]，而PPARα激動劑非諾貝特能通過緩解脂毒性而減輕DKD小鼠的微量白蛋白尿，其具體機制為激活A(yù)MPK信號通路、改善氧化應(yīng)激與炎癥狀態(tài)[2]。最近的報道顯示，中成藥黃葵能通過激活PPARα/γ受體進而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與JNK活化，減輕DKD的炎癥和腎小球損害[3]。脂質(zhì)代謝在慢性腎臟病中的作用越來越受到關(guān)注，如脂毒性學(xué)說:過多的膽固醇、三酰甘油等脂質(zhì)在腎臟異位沉積與DKD發(fā)生及腎小球硬化有關(guān)。
　

10、　DKD屬于中醫(yī)消渴病腎病范疇，病名提示:病位主要在腎。其基本病機為:脾氣虧損、脾不攝精、精氣下陷。腎不藏精、攝精無權(quán)、精氣下泄。早期:氣血兩虛、淤血阻絡(luò)。中期:脾腎不足、虛陽上亢、水濕潴留、泛濫肌膚、夾有淤血。晚期:濁毒內(nèi)停、耗傷氣血、腎陽衰敗、水飲不化、上凌心肺。病程始終貫穿腎元受損的病理。臨床治療注重護腎培元。在中醫(yī)中藥方面，有上千年治療糖尿病腎臟病的歷史，對降低蛋白尿，延緩腎功能減退以及改善生活質(zhì)量等方面具有豐富的臨床治療經(jīng)驗。

11、雖然臨床經(jīng)驗和相關(guān)實驗研究提示一些中藥方劑或有效單體具有預(yù)防及治療DKD的作用，但缺乏相關(guān)防治DKD的確切機制及相關(guān)具體通路研究，其臨床推廣遇到瓶頸。臨床研究中發(fā)現(xiàn)大黃、黃芪苷、槲皮素、黃芩苷、冬蟲夏草等中草藥制劑或知柏地黃丸、鹽酸小檗堿、當(dāng)歸補血湯和五苓散、糖腎方等中成藥對DKD有一定的保護作用，提示中醫(yī)中藥可為DKD的防治提供有價值的指導(dǎo)。
　　落新婦苷(Astilbin)是從傳統(tǒng)中藥土茯苓中提取的黃酮類化合物，據(jù)文獻報道，落

12、新婦苷具有多種顯著的生物學(xué)活性，具有抗炎癥、抗氧化功能。近年來又有報道稱落新婦苷有顯著的選擇性免疫抑制作用，抑制T細(xì)胞活化和遷移，具有不同于環(huán)孢霉素A的免疫抑制活性，作為一種新的免疫抑制劑，落新婦苷可用于免疫相關(guān)疾病的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)落新婦苷在大鼠缺血再灌注模型中可通過抑制趨化因子MCP-1及細(xì)胞因子IL-6和IL-18的產(chǎn)生減輕腎臟缺血再灌注的損傷，但其在DKD防止中的作用及機制尚無相關(guān)研究報道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)落新婦苷可以激活

13、PPARα/γ，從而改善胰島素敏感性，并可以部分逆轉(zhuǎn)腎小管上皮轉(zhuǎn)分化。由此我們推測，落新婦苷可能通過上調(diào)PPARα/γ表達(dá)抑制糖尿病腎臟病腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　本研究我們首先利用細(xì)胞因子芯片技術(shù)分析不同類型糖尿病患者外周血炎癥相關(guān)因子和T細(xì)胞亞群的變化;并在明確PPARα/γ參與糖尿病腎病的基礎(chǔ)上，通過糖尿病腎病患者腎臟組織研究、體外細(xì)胞試驗及構(gòu)建糖尿病大鼠腎病模型，從而闡明落新婦苷在減輕糖尿病腎病上的作用及其機制，為糖尿病

14、腎病的治療提供新的手段。
　　第一部分不同類型糖尿病T細(xì)胞亞群和相關(guān)炎癥因子的分析
　　目的:
　　探討不同類型糖尿病T細(xì)胞亞群和相關(guān)炎癥因子的分析。
　　方法:
　　選取正常對照組20例、2型糖尿病20例、經(jīng)典1型糖尿病18例、暴發(fā)型1型糖尿病12例，簽署知情同意書后抽取外周血，分離血細(xì)胞，分別檢測20種細(xì)胞因子的水平及T細(xì)胞亞群，通過檢測CD4+CD25+FOXP3+、CD8+CD44+、CD4+CD4

15、4+、CD4+NKG2D+、CD4+IFN-γ+細(xì)胞、NK+NKG2D+細(xì)胞的頻率來分析1型糖尿病患者普通型與暴發(fā)型外周血相關(guān)淋巴細(xì)胞的頻率與表型;分離血清，-80℃凍存，利用細(xì)胞因子芯片檢測不同臨床表型血清炎性細(xì)胞因子的水平，比較1型糖尿病患者普通型與暴發(fā)型血清相關(guān)炎性細(xì)胞因子的變化。
　　結(jié)果:
　　1型糖尿病患者CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞頻率較正常對照組明顯降低， CD4+IFN-γ+細(xì)胞頻率明顯增高，CD8+

16、IFN-γ+細(xì)胞頻率明顯增高，具有趨化潛能CD4+、CD8+細(xì)胞的頻率明顯增高;暴發(fā)型1型糖尿病患者Th1細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子較普通1型糖尿病患者顯著增高，其中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MIP-1β、IL-12p70、IP-10、IFN-γ、 IL-9明顯升高，而IL-17A，IL-15和IL-10在普通1型糖尿病、暴發(fā)型1型糖尿病，2型糖尿病中無明顯差異。MCP-1，MIP-1a，F(xiàn)ractalkine和MCP-3在各組

17、之間分布無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1型糖尿病患者外周血Treg和Th1細(xì)胞失衡，Treg明顯降低，而Th1細(xì)胞亞群明顯升高，暴發(fā)型1型糖尿病患者Th1細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子較普通1型糖尿病患者顯著增高。
　　第二部分PPARα/γ在糖尿病腎臟病腎活檢組織中的表達(dá)
　　目的:
　　觀察PPARα/γ在糖尿病腎臟病腎活檢組織中的表達(dá)水平。分析PPARα/γ與腎臟纖維化是否具有相關(guān)性。
　　方法:
　　

18、糖尿病腎臟病患者共18例，男10例，女8例，平均年齡72歲9個月。正常對照組腎臟組織（腎臟腫瘤切除術(shù)后腫瘤周邊腎組織）共8例。應(yīng)用免疫組化檢測活檢腎組織中PPARα/γ的表達(dá)。分析PPARα/γ與腎臟病理評分的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　對照組免疫組化染色結(jié)果顯示腎臟組織都可見PPARα/γ表達(dá)，但在小管中近段腎小管表達(dá)最多，遠(yuǎn)端小管、集合管表達(dá)相對較少，在腎小球中系膜細(xì)胞表達(dá)較多，糖尿病腎臟病的活檢腎組織PPARα/γ表達(dá)量

19、較對照組明顯減少，減少近50％。半定量分析顯示PPARα/γ減少與腎臟損傷病理評分呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　PPARα/γ在糖尿病腎臟病患者腎組織中表達(dá)減少， PPARα/γ在糖尿病腎臟病腎臟纖維化中與腎臟病理評分有負(fù)相關(guān)性。
　　第三部分落新婦苷通過激活PPARα/γ抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞表型改變
　　目的:
　　在體外揭示落新婦苷刺激對高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞表型改變的影響。
　　方法:
　　體

20、外培養(yǎng)人系膜細(xì)胞，應(yīng)用不同濃度的高糖(5.5，15，20，30mM)刺激，觀察高糖對系膜細(xì)胞表型改變的影響。落新婦苷(25mg/L)預(yù)處理系膜細(xì)胞，再給予高糖(30mM)刺激，觀察落新婦苷對高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞表型改變的影響。采用Western blotting和qRT-PCR檢測PPARα/γ以及成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)及MMP-9的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1) PPAR-γ蛋白水平在高糖濃度為15mM即有明顯抑

21、制(35％，P＜0.01)，濃度為30mM時抑制達(dá)到最大80％(P＜0.01)，PPAR-γ mRNA水平水平也在高糖濃度15mM即有明顯降低(45％，P＜0.01)，并誘導(dǎo)系膜細(xì)胞表型改變，MMP-9在高糖濃度為15mM時明顯降低(P＜0.05)，而α-SMA明顯升高(P＜0.05)，隨著高糖刺激濃度增加，上述差異性更為顯著。(2)體外培養(yǎng)人系膜細(xì)胞，經(jīng)落新婦苷(25mg/L)刺激24h，PPAR-α表達(dá)明顯增加，約升高2倍(P＜0.

22、05);而PPAR-γ也增加到1.5倍，增加55％(P＜0.05)。(3)高糖刺激后，HG組α-SMA表達(dá)較正常對照升高約2倍(P＜0.05)，而MMP-9明顯降低（降低約45％，p＜0.05），而給予落新婦苷能明顯部分抑制高糖誘導(dǎo)的α-SMA升高（較HG組降低約30％，P＜0.05）及阻斷MMP-9的降低（較HG組升高約55％，P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　落新婦苷通過激活PPARα/γ的表達(dá)，抑制人系膜細(xì)胞表型改變，

23、提示落新婦苷在維持人系膜細(xì)胞正常功能中發(fā)揮重要作用。
　　第四部分落新婦苷在大鼠體內(nèi)對糖尿病腎臟病的影響
　　目的:
　　分析落新婦苷在體內(nèi)對糖尿病腎臟病的作用及相關(guān)機制研究。
　　方法:
　　選擇70只大鼠(45-50d)，體重為200-220g的雄性健康SD清潔級大鼠（購自揚州大學(xué)實驗動物中心），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組（Cntl，10只），糖尿病腎臟病組（DN組，20只），糖尿病腎臟病+低

24、劑量落新婦苷組（DN-LD-Ast組，10只），糖尿病腎臟病+中劑量落新婦苷組(DN-MD-Ast組，10只)，糖尿病腎臟病+高劑量落新婦苷組（DN-HD-Ast組，10只），糖尿病腎病+羅格列酮組（DN組+RGZ組，10只）。對照組以普通飼料喂養(yǎng)，DN組使用高脂飼料喂養(yǎng)，12周后，后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(40mg/kg，腹腔內(nèi)一次性注射)，對照組腹腔注射同等劑量的0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(Ph=4.4)。一周

25、檢測一次血糖，代謝籠收集24 h尿，測尿微量白蛋白，微量白蛋白/肌酐＞30mg/g為糖尿病腎臟病造模成功。落新婦苷劑量分別按1.25(LD-Ast)、2.5(MD-Ast)、5(HD-Ast) mg/kg/d溶解在生理鹽水中腹腔注射，12周后水合氯醛麻醉處死小鼠，留取血清、尿及腎組織標(biāo)本、肝臟標(biāo)本。檢測血清生化指標(biāo)（甘油三酯，膽固醇，低密度脂蛋白、高密度脂蛋白，血肌酐，尿素氮，白蛋白等），Western blotting和qRT-PCR

26、檢測PPARα/γ的表達(dá)以及成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白MMP-9、α-SMA和desmin的表達(dá)，腎臟病理TGF-β1、CollⅣ免疫組化，PAS染色光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果:
　　(1)DN大鼠空腹血糖較正常組明顯異常，中位數(shù)26.24mmol/L，升高具有統(tǒng)計學(xué)差異，低劑量和中劑量空腹血糖較正常對照組無明顯差異，而高劑量組能明顯改善空腹血糖;DN大鼠體重較正常對照組明顯減輕，攝水量、尿量較正常組升高十倍左右，尿蛋白

27、明顯升高，其變化有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)落新婦苷干預(yù)后，不同劑量落新婦苷減輕尿蛋白的效果不一樣，低劑量和中劑量落新婦苷能部分降低蛋白尿水平，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量落新婦苷能顯著降低尿蛋白水平，其改變有顯著差異(P＜0.01)，在糖尿病腎臟病大鼠模型中，TGF-β1在腎小球表達(dá)較少，半定量分析提示DN組TGF-β1升高了約4倍，低劑量和中劑量落新婦苷能抑制TGFβ1的升高，較DN組降低了約25％，而高劑量落新婦苷則能降低約50％(P＜0.0