Sonic Hedgehog信號通路異常激活在肺癌、肝癌中作用的研究.pdf

1、癌癥是人類生命的最大威脅之一，研究癌癥致病機理是當(dāng)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的熱門和前沿領(lǐng)域。 肺癌是世界癌癥相關(guān)死亡重要的類型，我國主要城市中肺癌發(fā)病率居各種惡性腫瘤的首位，死亡率已經(jīng)超過世界平均水平。在美國，肺癌平均每年奪去150,000的生命(超過乳腺癌，前列腺癌和結(jié)直腸癌死亡人數(shù)的總合)。新發(fā)現(xiàn)的肺癌病人中，75﹪已經(jīng)是肺癌晚期，醫(yī)學(xué)認(rèn)為存活期僅為10個月。 肝癌是人類消化系統(tǒng)主要的腫瘤類型，而肝細(xì)胞肝癌(Hepat

2、ocellularcarcinomas，HCC)是其中最主要的類型，也是世界上重要的惡性腫瘤之一。肝癌在中國的惡性腫瘤死亡序位已高居第二位，年死亡率為20-40/10萬人。在美國，每年因HCC死亡的人數(shù)為14000人，占腫瘤相關(guān)死亡人數(shù)的第八位。大量患者(70-85﹪)由于年老或者其它疾病，預(yù)后非常差，而且化療在HCC的治療方面也作用甚微。 Sonic Hedgehog(SHH)通路在胚胎發(fā)育、器官極性和細(xì)胞增殖過程中都起重要

3、作用。作為胚胎發(fā)育過程中起到重要作用的信號通路，SHH信號通路已經(jīng)被很清楚地證明，在成體組織中通過突變或者其他機制而被激活，從而在腫瘤發(fā)生中起到至關(guān)重要的作用。包括皮膚基底細(xì)胞癌，肺癌，胃癌，前列腺癌，結(jié)直腸癌，胰腺癌等。特異性抑制SHH通路活性可以抑制這些腫瘤細(xì)胞的增殖。 本論文主要關(guān)注中國高發(fā)性腫瘤肝細(xì)胞肝癌和肺癌中SHH通路的情況。主要研究思路是：首先檢查SHH通路靶基因以及主要作用分子的表達(dá)：然后尋找這種異常的通路活性

4、是如何產(chǎn)生的；最后研究SHH通路在細(xì)胞功能，增殖等方面的作用，本研究的成果可為闡明腫瘤發(fā)病的機理提供新資料。 對于肺癌中SHH通路的研究開始于1997年，并已有大量證據(jù)顯示SHH通路在不同肺癌類型中存在不同類型的激活。但是關(guān)于其激活的機率還沒有報道。本文第二部分通過原位雜交和免疫組化等技術(shù)，檢測了肺癌中是否存在存在SHH通路的激活，發(fā)現(xiàn)在肺癌中僅有不超過10﹪的病例存在SHH靶基因的表達(dá)上調(diào)。在部分存在SHF{異常激活的病例中

5、，發(fā)現(xiàn)了通路負(fù)調(diào)控基因Su(fu)的表達(dá)缺失。結(jié)果表明，SHH的異常激活在肺癌中僅存在于一小部分病例中，并且這種激活可能由于SHH配體的過表達(dá)或者Su(fu)的功能缺失引起．本文首次報道了SHH通路中其他一些重要成員在肺癌中的表達(dá)情況。如通路受體之一Smoothened(SMO)，負(fù)調(diào)控基因Rab23，下游靶基因platelet-derivedgrowth factor receptor alpha(PDGFRa)，hedgehog i

6、nteracting protein(HIP)以及SHH啟動子調(diào)控子hepatocyte nuclear factor 3-beta(HNF3β)。并且檢測和分析了在皮膚基底細(xì)胞癌中存在獲得功能型突變的SMO的第十外顯子是否在肺癌中也存在突變，而產(chǎn)生了配體非依賴的通路活性。 研究結(jié)果顯示，雖然SHH通路在肺癌中的激活并不普遍，但是一些通路重要成員卻存在高頻率的過表達(dá)，包括SMO，Rab23以及PDGFRa，而通路抑制基因之一的

7、HIP則在一些病例中表達(dá)下調(diào)。另外，本實驗中，首次報道Rab23基因的核定位。結(jié)果暗示了SHH通路的激活方式可能在不同腫瘤類型中存在差異。并且，雖然通過PCR-SSCP檢測發(fā)現(xiàn)較為普遍的SMO第十外顯子出現(xiàn)異常條帶，但是測序發(fā)現(xiàn)僅有一個病例存在雜和突變，顯示出SMO的第十外顯子突變在肺癌中可能不是引起通路激活的主要原因之一，但是在腫瘤病例中出現(xiàn)的異常SSCP條帶仍然給了我們有趣的線索。 綜上所述，研究表明，雖然肺癌中SHH激活

8、并非廣泛存在，但許多SHH通路的分子在肺癌中廣泛表達(dá)。 文章第三部分首次報道SHH信號通路在HCC中高頻率的激活。在115例癌癥組織和44例癌旁組織中檢測了SHH的表達(dá)，以及靶基因PTCl、Glil的表達(dá)。在超過60﹪的HCC組織中存在SHH的表達(dá)，與之一致的是，超過50﹪的病例存在靶基因PTCl和Glil的表達(dá)，顯示了SHH活性在HCC中廣泛存在。同時檢測了HCC細(xì)胞系Hep3B中存在SHH激活，并且通路抑制劑KAAD-cy

9、clopamine處理細(xì)胞，可以引起細(xì)胞凋亡以及生長抑制，而這種作用在轉(zhuǎn)染了pCS2-GIil表達(dá)載體的細(xì)胞中則被減弱。采用RNAi技術(shù)抑制Glil活性，同樣可以引起細(xì)胞凋亡，而在沒有通路活性的HepG2細(xì)胞中，這些處理則沒有影響。實驗揭示了SHH通路在HCC的生長、增殖中起重要作用。 SHH信號通路是很多的分子形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。作者也檢測了其他通路分子的表達(dá)情況。結(jié)果除了顯示出SMO的過表達(dá)，以及部分腫瘤也存在Rab23表

10、達(dá)的上調(diào)，這種上調(diào)暗示雖然作為通路的負(fù)調(diào)控分子，Rab23可能同PTCl一樣，也是通路的靶基因之一。與肺癌的情況相似，在HCC中也發(fā)現(xiàn)了Rab23的核定位。原位雜交結(jié)果還顯示，HCC中沒有PDGFRα的表達(dá)，這一結(jié)果暗示HCC中的SHH通路下游靶基因網(wǎng)絡(luò)可能不同于其他腫瘤。通過PCR-SSCP檢測同樣也發(fā)現(xiàn)較為普遍的第十外顯子出現(xiàn)異常條帶。突變的結(jié)果把一個脯氨酸Pro變成了絲氨酸Ser，這是一個從非極性氨基酸，變成極性氨基酸的突變，這個

11、突變有可能改變胞內(nèi)區(qū)的結(jié)構(gòu)域，從而引起蛋白功能的改變。但是在檢測的十例組織中，僅有一例存在這種突變，也說明SMO第十外顯子的突變可能不是引起HCC中SHH通路激活的原因。研究創(chuàng)新點： 本論文的工作通過對大量肺癌病例的檢測，首次研究了肺癌中SHH信號通路異常激活的機率。首次系統(tǒng)研究了SHH通路關(guān)鍵分子在肺癌中表達(dá)的情況。首次報道了在中國高發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中有大量病例存在SHH信號通路異常激活的情況。并且，在細(xì)胞水平上，檢測了SHH