Sonic Hedgehog信號(hào)通路活性下調(diào)參與人類肝細(xì)胞癌中5-FU抑癌作用的研究.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文SonicHedgehog信號(hào)通路活性下調(diào)參與人類肝細(xì)胞癌中5FU抑癌作用的研究姓名：王啟宇申請學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：張紅衛(wèi)20081025作濃度。5FU作用于Hep3B細(xì)胞6h，12h，24h和48h時(shí)，通過半定量RTPCR檢測，發(fā)現(xiàn)5FU可以下調(diào)SHh通路靶基因P億J『(Patched“和Glil(gliomaassociatedoncogenehornolog”、配體基因SHH(SonicHe

2、dgehog)和受體基因SMO(Smoothened)的表達(dá)，表明5FU對(duì)Hep3B細(xì)胞中SHh信號(hào)通路的主要元件的基因轉(zhuǎn)錄有影響。而在SHh通路無活性的HepG2細(xì)胞中，沒有檢測到P陀J和Glil表達(dá)，配體SHH也沒有受到明顯影響。為確定SHh通路的活性是否參與5FU引發(fā)的生長阻滯和細(xì)胞凋亡，本研究通過pCS2Glil質(zhì)粒使Hep3B細(xì)胞過表達(dá)Glil，用MTT檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施加相同濃度的5FU時(shí)，轉(zhuǎn)染組比非轉(zhuǎn)染組的Hep3B細(xì)胞具有更

3、高的生長曲線；臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)更是直接驗(yàn)證了MTT的檢測結(jié)果；吖啶橙熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了細(xì)胞核發(fā)生了明顯的凝縮、邊緣化和片段化，并有凋亡小體出現(xiàn)外，5FU處理48h的轉(zhuǎn)染組比非轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡比例明顯減少；而用Hochest33258的熒光檢測，除了發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核在形態(tài)上有明顯的凋亡特征外，還發(fā)現(xiàn)5FU處理組比對(duì)照組的亮度強(qiáng)很多，熒光強(qiáng)度比較顯著(幸，p005)，而Glil轉(zhuǎn)染組的Hep3B細(xì)胞與對(duì)照組相比，雖然熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)，但程度不明

4、顯；用TUNEL檢測以及相應(yīng)的熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中Glil轉(zhuǎn)染組中TUNEL陽染的細(xì)胞數(shù)量減少，而未轉(zhuǎn)染Glil的實(shí)驗(yàn)組中陽染的細(xì)胞數(shù)量較多，5FU引發(fā)的凋亡更為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組以及5FU處理的非轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組Hep3B細(xì)胞中Glil的過表達(dá)可以拮抗5FU引發(fā)的細(xì)胞生長阻滯和細(xì)胞凋亡。使Hep3B細(xì)胞過表達(dá)Glil，從而上調(diào)SHh通路活性上調(diào)，可在一定程度上降低Hep3B細(xì)胞對(duì)5FU的敏感性，增強(qiáng)Hep3B細(xì)胞

5、對(duì)5FU的拮抗作用。本研究的劃痕損傷愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使Hep3B細(xì)胞過表達(dá)Glil可以拯救5FU引起的遷移能力的降低，表明在SHh通路激活的腫瘤細(xì)胞中5FU對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響可能涉及對(duì)通路活性的抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Glil的Hep3B細(xì)胞可以拮抗5FU引發(fā)的PTCl蛋白亞細(xì)胞定位的改變。本研究用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測法(ICC，Immunocytochemistry)對(duì)Hep3B細(xì)胞中PTCl蛋白的亞細(xì)胞定位的變化進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)