一種IgM單克隆抗體快速高效制備平臺(tái)的建立.pdf

1、單克隆抗體由于其特異性及高親和力被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷及治療。目前單克隆抗體制備技術(shù)主要有雜交瘤技術(shù)，噬菌體等展示技術(shù)以及B細(xì)胞篩選等，而這些技術(shù)具有周期長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜，費(fèi)用高等缺點(diǎn)。
　　本研究擬利用雞B淋巴瘤細(xì)胞(DT40)建立一種快速高效的單克隆抗體制備系統(tǒng)。DT40細(xì)胞免疫球蛋白可變區(qū)基因(IgV)持續(xù)發(fā)生高頻基因轉(zhuǎn)換及點(diǎn)突變，使其本身形成一個(gè)天然的抗體庫(kù)，受AID基因調(diào)控，在獲得分泌特異抗體的細(xì)胞后需關(guān)閉

2、AID表達(dá)以免已獲得的特異性抗體繼續(xù)發(fā)生突變。為此，本研究的關(guān)鍵為構(gòu)建一個(gè)AID可調(diào)控表達(dá)的DT40細(xì)胞系。首先，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除DT40細(xì)胞中AID基因。在遺傳學(xué)水平上通過基因測(cè)序驗(yàn)證AID基因被敲除;在蛋白水平上，通過Western-blotting檢測(cè)AID蛋白不表達(dá);進(jìn)一步通過免疫球蛋白可變區(qū)基因測(cè)序，在功能學(xué)水平驗(yàn)證AID在細(xì)胞中功能的缺失。隨后，在AID基因缺失細(xì)胞株中穩(wěn)定表達(dá)可調(diào)控的AID基因，并

3、通過Western-blotting驗(yàn)證AID蛋白表達(dá)并通過IgV區(qū)基因測(cè)序驗(yàn)證AID誘導(dǎo)IgV基因突變，從而實(shí)現(xiàn)DT40細(xì)胞中AID基因的可調(diào)控表達(dá)。最后，利用磁珠偶聯(lián)的寨卡病毒NS1蛋白對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行篩選從而獲得分泌抗NS1抗體的DT40細(xì)胞克隆，通過ELISA篩選和驗(yàn)證抗體的親和力以及特異性。該單克隆抗體制備系統(tǒng)的建立彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了單克隆抗體的快速制備，還可實(shí)現(xiàn)抗體親和力成熟，在基礎(chǔ)研究和臨床診斷中具有廣