鹽霉素誘導(dǎo)細胞周期阻滯和抗血管生成抑制人腦膠質(zhì)瘤生長機制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤指源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞的腦部腫瘤。流行病學(xué)資料顯示膠質(zhì)瘤在全部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤類型所占比例為27％，在惡性腫瘤類型所占比例為80％，是最常見原發(fā)性腫瘤類型。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)將膠質(zhì)瘤分級WHOⅠ～Ⅳ級，以判斷腫瘤惡性程度。高級別膠質(zhì)瘤具有較強的侵襲性，臨床治療效果差，患者預(yù)后不佳，平均生存率只有12-15個月。盡管采取目前的方法來治療膠質(zhì)瘤其療效不能讓人滿意，但是手術(shù)切除后和放療

2、后采取合適的化療藥物進行化療仍然是不可替代的方案。
　　鹽霉素(salinomycin，SAL)為一種一元羧酸聚醚類動物專用抗生素。2009年，美國人率先證實SAL能夠有效地殺死乳腺癌腫瘤干細胞。之后SAL在各類腫瘤實驗性研究被證實對多種類型腫瘤細胞與腫瘤干細胞具有抑制與殺傷，如鼻咽癌，骨肉瘤，肝細胞癌，膽管癌，胃癌以及膠質(zhì)瘤等。鹽霉素抗腫瘤的機制研究表明其具有廣譜的抗癌活性，它可能通過激活非傳統(tǒng)的細胞死亡途徑，誘導(dǎo)脫氧核糖核酸(

3、deoxyribonucleic acid，DNA)損傷，抑制Wnt信號通路，凋亡和/或自噬，抗血管新生等機制發(fā)揮作用。
　　報道據(jù)鹽霉素能夠提高細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量，從而導(dǎo)致細胞凋亡或壞死，DNA損傷以及抑癌基因p53活化抑制膠質(zhì)瘤細胞增生。而且大量證據(jù)提示，ROS在SAL抗癌作用機理中起到主要作用。然而鹽霉素利用氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細胞周期阻滯的研究未見報道。因此在本研究中，

4、將評價在鹽霉素引起U87人膠質(zhì)瘤細胞周期阻滯的過程中，ROS、DNA損傷以及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/theronine protein kinase，AKT)失活所起到的作用。
　　血管生成機制為腫瘤向遠處轉(zhuǎn)移與生長機制當中主要組成部分。腫瘤只有在豐富的血管床支持下，在得到足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上才可能生長與延伸，因此血管發(fā)生與腫瘤生長是平行的。腫瘤組織內(nèi)新血管生成為多重機制參與，多個成分參加的復(fù)雜過程，并且受到

5、由腫瘤細胞等分泌的促血管生成與抗血管生成因子調(diào)節(jié)。兩種因子生成達到平衡時，血管新生處于相對靜止，而平衡破壞時即觸發(fā)血管新生。腫瘤血管生成有2種基本形式，出芽與套疊式血管生成。腫瘤血管生成特點比較突出，如高度增殖的內(nèi)皮細胞，血管通透性比較高以及促血管生長因子分泌旺盛，因此可以將血管生成作為治療新靶點。
　　當血管生成啟動后，腫瘤細胞會分泌出促血管形成因子誘導(dǎo)內(nèi)皮增殖。由腫瘤細胞產(chǎn)生的具有促血管生成效應(yīng)的分子逐漸被人們所認識，也鑒定出

6、多種類似于內(nèi)皮細胞分泌的促血管生成分子。最近許多文獻報道，以血管生成的調(diào)節(jié)因子為治療靶點，通過小分子受體阻滯抑制劑、特異性抗體或內(nèi)源性抑制劑來抑制內(nèi)皮細胞聚積。
　　實驗研究證實以血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為治療靶點可以有效阻滯血管發(fā)生。VEGF是組織結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的細胞因子家族當中非常重要的一員，在血管發(fā)生、促進細胞生存、生長方面起到重要作用，并和VEGF

7、受體結(jié)合調(diào)節(jié)動脈、靜脈中內(nèi)皮增殖。目前已經(jīng)鑒定出三種不同血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factorreceptor，VEGFR)，VEGFR-1(Flt-1),VEGFR-2(Flk-1)和VEGFR-3。
　　局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)為一種胞漿蛋白質(zhì)絡(luò)氨酸激酶，與整合蛋白介導(dǎo)的通路密切相關(guān)，在細胞增生，存活與遷移活動內(nèi)起到關(guān)鍵作用。整合蛋

8、白聚類激活FAK，后者又引起PI3K結(jié)合位點Tyr397磷酸化。已有文獻證實不論是整合蛋白介導(dǎo)FAK活化，或是生長因子刺激促進了PI3K/Akt下游途徑活化，均會引起癌性轉(zhuǎn)移前蛋白過度表達，例如基質(zhì)金屬蛋白酶與VEGF。
　　鹽霉素抗腫瘤機制研究中有證據(jù)顯示，其通過引起DNA損傷與線粒體功能障礙，以及FOXO3a，Wnt/β-catenin，STAT3/Skp2和Akt/NF-κB/mTOR信號通路參與的ROS聚集這些機制來抑制膠

9、質(zhì)瘤細胞生長。但是少有文獻報道SAL對腫瘤血管發(fā)生影響。因此本研究將鹽霉素作為血管生成抑制劑評價其在離體和在體情況下的抗癌作用。并探究其抑制血管生成和引起膠質(zhì)瘤細胞死亡的潛在機制。
　　目的:
　　1.探討SAL在離體情況下對U87與U251膠質(zhì)瘤細胞系和在體情況下對U87膠質(zhì)瘤細胞移植瘤生長的抑制，圍繞細胞周期阻滯探討潛在機制。
　　2.探討SAL在離體情況下對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vei

10、nendothelial cells，HUVECs)增殖、遷移、侵襲和血管形成能力的影響，在體情況下對U251膠質(zhì)瘤細胞移植瘤生長的抑制作用，圍繞血管生成探討其潛在機制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)U87和U251膠質(zhì)瘤細胞并擴增，設(shè)正常對照組和SAL治療組。以不同濃度SAL（0，1，2，4，8μM）治療48 h，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，四氮唑溴鹽(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-di

11、phenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法檢測細胞活力。應(yīng)用細胞流式技術(shù)分析細胞周期分布。DCFH-DA探針測定細胞內(nèi)ROS水平，超氧陰離子試劑盒測定細胞內(nèi)超氧陰離子含量。蛋白質(zhì)印跡法測定SAL對細胞周期調(diào)節(jié)因子CyclinA、CDK-2、Cyclin B1和Cyclin D1，DNA損傷標記蛋白H2A和p53，和其他信號途徑蛋白(AKT)表達影響。應(yīng)用各種蛋白抑制劑與ROS清除劑谷胱甘肽探討SAL對細胞周

12、期影響。構(gòu)建U87膠質(zhì)瘤細胞移植瘤模型，分組設(shè)對照，對比移植瘤大體形態(tài)參數(shù)與模型體重。對腫瘤標本進行蛋白質(zhì)印跡法與免疫組織化學(xué)分析。
　　2.體外培養(yǎng)HUVECs并擴增。不同濃度(0 uM，0.1 uM，0.5 uM，1 uM，2 uM，4uM，8 uM)的SAL作用HUVECs48 h。倒置相差顯微鏡記錄細胞形態(tài)，MTT法檢測細胞活性。劃痕試驗、體外侵襲實驗和促血管形成實驗評價SAL作用后HUVECs的遷移能力、侵襲能力和血管形

13、成能力，并設(shè)立陽性(VEGF)和陰性（順鉑）對照。蛋白質(zhì)印跡法測定SAL對血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF，VEGF受體，以及其他信號途徑蛋白(p-FAK、FAK、AKT、p-AKT)表達的影響。增加使用各種蛋白抑制劑探究SAL對血管發(fā)生影響。構(gòu)建U251膠質(zhì)瘤細胞移植瘤模型，分組設(shè)對照，對比移植瘤大體形態(tài)參數(shù)與模型體重。對腫瘤標本進行蛋白質(zhì)印跡法與免疫組化分析。
　　結(jié)果:
　　1.在SAL作用下，由MTT分析得到的U87和U25

14、1細胞活力受到明顯抑制，呈劑量依賴性;鏡下顯示細胞萎縮，突觸縮減，數(shù)量變小。流式細胞技術(shù)結(jié)果表明SAL主要誘導(dǎo)U87細胞S期和U251細胞G1期細胞周期抑制，蛋白質(zhì)印跡法顯示CyclinA、CDK-2、Cyclin B1和Cyclin D1表達下調(diào)，結(jié)果保持一致。SAL作用下細胞內(nèi)ROS和超氧陰離子水平增高，H2A和p53表達增強，而增加谷胱甘肽后H2A和p53表達下降，提示ROS引起DNA損傷。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示SAL作用下p-AK

15、T表達下調(diào)，增加LY294002（AKT抑制劑）后表現(xiàn)出兩者的協(xié)同作用，增加谷胱甘肽后兩者表現(xiàn)出對p-AKT表達的拮抗作用。動物實驗數(shù)據(jù)提示腫瘤標本體積和重量受到SAL抑制。免疫組化結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)的細胞增生（Ki-67染色）和血管發(fā)生（CD-31染色）同樣受到抑制。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果鹽霉素激活了Ser15-p53和Ser139-H2A，抑制了AKT和cyclin A表達。綜合以上結(jié)果表明，鹽霉素在體內(nèi)可以抑制膠質(zhì)瘤生長。
　　2

16、.MTT分析提示SAL對HUVECs生長具有劑量依賴性抑制作用，鏡下顯示細胞數(shù)量減少，細胞形態(tài)萎縮和變圓。劃痕試驗、體外侵襲實驗和促血管形成實驗數(shù)據(jù)提示鹽霉素能夠阻止HUVECs遷移，侵襲和形成類毛細血管形成。蛋白質(zhì)印跡法提示SAL作用下p-FAK表達下調(diào)，聯(lián)合使用PF562271能增強這種作用，提示SAL抑制HUVECs中FAK的磷酸化。蛋白質(zhì)印跡法還表明，SAL作用下VEGF、p-VEGFR2與p-AKT表達下降，提示SAL干擾了V

17、EGF-VEGFR2-AKT信號途徑。SAL作用下在體腫瘤體積和重量下降，免疫熒光染色顯示細胞增生的標記物Ki-67和造血祖細胞標記物CD34表達，同時蛋白質(zhì)印跡法顯示治療組織內(nèi)p-FAK和p-AKT表達減少，以上結(jié)果提示鹽霉素通過阻礙血管新生抑制體內(nèi)膠質(zhì)瘤生長。
　　結(jié)論:
　　1.鹽霉素通過ROS介導(dǎo)的DNA損傷和AKT失活引起細胞周期阻滯，從而抑制膠質(zhì)瘤的生長。
　　2.鹽霉素通過干擾VEGF-VEGFR2-AK