鹽霉素誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和抗血管生成抑制人腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)機(jī)制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤指源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腦部腫瘤。流行病學(xué)資料顯示膠質(zhì)瘤在全部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤類型所占比例為27％，在惡性腫瘤類型所占比例為80％，是最常見原發(fā)性腫瘤類型。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)將膠質(zhì)瘤分級(jí)WHOⅠ～Ⅳ級(jí)，以判斷腫瘤惡性程度。高級(jí)別膠質(zhì)瘤具有較強(qiáng)的侵襲性，臨床治療效果差，患者預(yù)后不佳，平均生存率只有12-15個(gè)月。盡管采取目前的方法來治療膠質(zhì)瘤其療效不能讓人滿意，但是手術(shù)切除后和放療

2、后采取合適的化療藥物進(jìn)行化療仍然是不可替代的方案。
　　鹽霉素(salinomycin，SAL)為一種一元羧酸聚醚類動(dòng)物專用抗生素。2009年，美國(guó)人率先證實(shí)SAL能夠有效地殺死乳腺癌腫瘤干細(xì)胞。之后SAL在各類腫瘤實(shí)驗(yàn)性研究被證實(shí)對(duì)多種類型腫瘤細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞具有抑制與殺傷，如鼻咽癌，骨肉瘤，肝細(xì)胞癌，膽管癌，胃癌以及膠質(zhì)瘤等。鹽霉素抗腫瘤的機(jī)制研究表明其具有廣譜的抗癌活性，它可能通過激活非傳統(tǒng)的細(xì)胞死亡途徑，誘導(dǎo)脫氧核糖核酸(

3、deoxyribonucleic acid，DNA)損傷，抑制Wnt信號(hào)通路，凋亡和/或自噬，抗血管新生等機(jī)制發(fā)揮作用。
　　報(bào)道據(jù)鹽霉素能夠提高細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，DNA損傷以及抑癌基因p53活化抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增生。而且大量證據(jù)提示，ROS在SAL抗癌作用機(jī)理中起到主要作用。然而鹽霉素利用氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的研究未見報(bào)道。因此在本研究中，

4、將評(píng)價(jià)在鹽霉素引起U87人膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯的過程中，ROS、DNA損傷以及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/theronine protein kinase，AKT)失活所起到的作用。
　　血管生成機(jī)制為腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與生長(zhǎng)機(jī)制當(dāng)中主要組成部分。腫瘤只有在豐富的血管床支持下，在得到足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上才可能生長(zhǎng)與延伸，因此血管發(fā)生與腫瘤生長(zhǎng)是平行的。腫瘤組織內(nèi)新血管生成為多重機(jī)制參與，多個(gè)成分參加的復(fù)雜過程，并且受到

5、由腫瘤細(xì)胞等分泌的促血管生成與抗血管生成因子調(diào)節(jié)。兩種因子生成達(dá)到平衡時(shí)，血管新生處于相對(duì)靜止，而平衡破壞時(shí)即觸發(fā)血管新生。腫瘤血管生成有2種基本形式，出芽與套疊式血管生成。腫瘤血管生成特點(diǎn)比較突出，如高度增殖的內(nèi)皮細(xì)胞，血管通透性比較高以及促血管生長(zhǎng)因子分泌旺盛，因此可以將血管生成作為治療新靶點(diǎn)。
　　當(dāng)血管生成啟動(dòng)后，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌出促血管形成因子誘導(dǎo)內(nèi)皮增殖。由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的具有促血管生成效應(yīng)的分子逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，也鑒定出

6、多種類似于內(nèi)皮細(xì)胞分泌的促血管生成分子。最近許多文獻(xiàn)報(bào)道，以血管生成的調(diào)節(jié)因子為治療靶點(diǎn)，通過小分子受體阻滯抑制劑、特異性抗體或內(nèi)源性抑制劑來抑制內(nèi)皮細(xì)胞聚積。
　　實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為治療靶點(diǎn)可以有效阻滯血管發(fā)生。VEGF是組織結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的細(xì)胞因子家族當(dāng)中非常重要的一員，在血管發(fā)生、促進(jìn)細(xì)胞生存、生長(zhǎng)方面起到重要作用，并和VEGF

7、受體結(jié)合調(diào)節(jié)動(dòng)脈、靜脈中內(nèi)皮增殖。目前已經(jīng)鑒定出三種不同血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factorreceptor，VEGFR)，VEGFR-1(Flt-1),VEGFR-2(Flk-1)和VEGFR-3。
　　局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)為一種胞漿蛋白質(zhì)絡(luò)氨酸激酶，與整合蛋白介導(dǎo)的通路密切相關(guān)，在細(xì)胞增生，存活與遷移活動(dòng)內(nèi)起到關(guān)鍵作用。整合蛋

8、白聚類激活FAK，后者又引起PI3K結(jié)合位點(diǎn)Tyr397磷酸化。已有文獻(xiàn)證實(shí)不論是整合蛋白介導(dǎo)FAK活化，或是生長(zhǎng)因子刺激促進(jìn)了PI3K/Akt下游途徑活化，均會(huì)引起癌性轉(zhuǎn)移前蛋白過度表達(dá)，例如基質(zhì)金屬蛋白酶與VEGF。
　　鹽霉素抗腫瘤機(jī)制研究中有證據(jù)顯示，其通過引起DNA損傷與線粒體功能障礙，以及FOXO3a，Wnt/β-catenin，STAT3/Skp2和Akt/NF-κB/mTOR信號(hào)通路參與的ROS聚集這些機(jī)制來抑制膠

9、質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。但是少有文獻(xiàn)報(bào)道SAL對(duì)腫瘤血管發(fā)生影響。因此本研究將鹽霉素作為血管生成抑制劑評(píng)價(jià)其在離體和在體情況下的抗癌作用。并探究其抑制血管生成和引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡的潛在機(jī)制。
　　目的:
　　1.探討SAL在離體情況下對(duì)U87與U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和在體情況下對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制，圍繞細(xì)胞周期阻滯探討潛在機(jī)制。
　　2.探討SAL在離體情況下對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vei

10、nendothelial cells，HUVECs)增殖、遷移、侵襲和血管形成能力的影響，在體情況下對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，圍繞血管生成探討其潛在機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞并擴(kuò)增，設(shè)正常對(duì)照組和SAL治療組。以不同濃度SAL（0，1，2，4，8μM）治療48 h，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，四氮唑溴鹽(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-di

11、phenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力。應(yīng)用細(xì)胞流式技術(shù)分析細(xì)胞周期分布。DCFH-DA探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，超氧陰離子試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子含量。蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定SAL對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CyclinA、CDK-2、Cyclin B1和Cyclin D1，DNA損傷標(biāo)記蛋白H2A和p53，和其他信號(hào)途徑蛋白(AKT)表達(dá)影響。應(yīng)用各種蛋白抑制劑與ROS清除劑谷胱甘肽探討SAL對(duì)細(xì)胞周

12、期影響。構(gòu)建U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤模型，分組設(shè)對(duì)照，對(duì)比移植瘤大體形態(tài)參數(shù)與模型體重。對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法與免疫組織化學(xué)分析。
　　2.體外培養(yǎng)HUVECs并擴(kuò)增。不同濃度(0 uM，0.1 uM，0.5 uM，1 uM，2 uM，4uM，8 uM)的SAL作用HUVECs48 h。倒置相差顯微鏡記錄細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。劃痕試驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)和促血管形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)SAL作用后HUVECs的遷移能力、侵襲能力和血管形

13、成能力，并設(shè)立陽性(VEGF)和陰性（順鉑）對(duì)照。蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定SAL對(duì)血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF，VEGF受體，以及其他信號(hào)途徑蛋白(p-FAK、FAK、AKT、p-AKT)表達(dá)的影響。增加使用各種蛋白抑制劑探究SAL對(duì)血管發(fā)生影響。構(gòu)建U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤模型，分組設(shè)對(duì)照，對(duì)比移植瘤大體形態(tài)參數(shù)與模型體重。對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法與免疫組化分析。
　　結(jié)果:
　　1.在SAL作用下，由MTT分析得到的U87和U25

14、1細(xì)胞活力受到明顯抑制，呈劑量依賴性;鏡下顯示細(xì)胞萎縮，突觸縮減，數(shù)量變小。流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果表明SAL主要誘導(dǎo)U87細(xì)胞S期和U251細(xì)胞G1期細(xì)胞周期抑制，蛋白質(zhì)印跡法顯示CyclinA、CDK-2、Cyclin B1和Cyclin D1表達(dá)下調(diào)，結(jié)果保持一致。SAL作用下細(xì)胞內(nèi)ROS和超氧陰離子水平增高，H2A和p53表達(dá)增強(qiáng)，而增加谷胱甘肽后H2A和p53表達(dá)下降，提示ROS引起DNA損傷。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示SAL作用下p-AK

15、T表達(dá)下調(diào)，增加LY294002（AKT抑制劑）后表現(xiàn)出兩者的協(xié)同作用，增加谷胱甘肽后兩者表現(xiàn)出對(duì)p-AKT表達(dá)的拮抗作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示腫瘤標(biāo)本體積和重量受到SAL抑制。免疫組化結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞增生（Ki-67染色）和血管發(fā)生（CD-31染色）同樣受到抑制。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果鹽霉素激活了Ser15-p53和Ser139-H2A，抑制了AKT和cyclin A表達(dá)。綜合以上結(jié)果表明，鹽霉素在體內(nèi)可以抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。
　　2

16、.MTT分析提示SAL對(duì)HUVECs生長(zhǎng)具有劑量依賴性抑制作用，鏡下顯示細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)萎縮和變圓。劃痕試驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)和促血管形成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示鹽霉素能夠阻止HUVECs遷移，侵襲和形成類毛細(xì)血管形成。蛋白質(zhì)印跡法提示SAL作用下p-FAK表達(dá)下調(diào)，聯(lián)合使用PF562271能增強(qiáng)這種作用，提示SAL抑制HUVECs中FAK的磷酸化。蛋白質(zhì)印跡法還表明，SAL作用下VEGF、p-VEGFR2與p-AKT表達(dá)下降，提示SAL干擾了V

17、EGF-VEGFR2-AKT信號(hào)途徑。SAL作用下在體腫瘤體積和重量下降，免疫熒光染色顯示細(xì)胞增生的標(biāo)記物Ki-67和造血祖細(xì)胞標(biāo)記物CD34表達(dá)，同時(shí)蛋白質(zhì)印跡法顯示治療組織內(nèi)p-FAK和p-AKT表達(dá)減少，以上結(jié)果提示鹽霉素通過阻礙血管新生抑制體內(nèi)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。
　　結(jié)論:
　　1.鹽霉素通過ROS介導(dǎo)的DNA損傷和AKT失活引起細(xì)胞周期阻滯，從而抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。
　　2.鹽霉素通過干擾VEGF-VEGFR2-AK