DADS誘導(dǎo)人惡性膠質(zhì)瘤U251細胞周期阻滯與凋亡及機制研究.pdf

1、目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)對人惡性膠質(zhì)瘤U251細胞增殖、細胞周期與凋亡的作用,探討其分子機制。
　　方法:采用MTT法檢測DADS抑制惡性膠質(zhì)瘤U251細胞增殖的IC50值;流式細胞術(shù)檢測 DADS對 U251細胞周期分布及凋亡率的影響;Real Time PCR、Western blot和免疫細胞化學(xué)分別檢測細胞周期與凋亡相關(guān)基因與蛋白的表達;光學(xué)顯微鏡觀察凋亡形態(tài)學(xué)改變。
　

2、　結(jié)果:DADS呈濃度依賴性抑制U251細胞增殖,15、30、45、60mg·L-1DADS對U251細胞增殖的抑制率分別為22.01％、38.82%、49.23%、55.27%,差異均有顯著性意義(P<0.05)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,不同濃度DADS作用人膠質(zhì)瘤U251細胞后,可阻滯細胞于G2/M期,且隨著濃度增加,其阻滯作用逐漸增強。15、30、45、60mg·L-1DADS分別為14.1±1.2%、25.0±0.6%、41.2±1

3、.4%、53.5±3.3%,較對照組9.6±0.9%差異具有顯著性意義(P<0.05)。免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,45mg·L-1DADS處理U251細胞48h后,cyclin B1與c-Myc蛋白表達明顯下調(diào),平均光密度值分別從0.52±0.09、0.56±0.08顯著下降至0.23±0.02、0.39±0.04(P<0.05)。Real Time PCR結(jié)果顯示,Cyclin B1、c-Myc mRNA表達分別下調(diào)0.42倍、0.63倍

4、(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示,Cyclin B1、c-Myc蛋白與β-actin平均灰度值比分別為1.1±0.14、1.2±0.15,明顯低于對照組1.7±0.15、2.2±0.19(P<0.05)。
　　光鏡下,未處理的U251細胞胞質(zhì)少,核大而深染,核漿比例大,可見核分裂。45mg·L-1DADS處理48 h后,U251細胞變圓,體積明顯縮小,胞漿強嗜酸性,核固縮、深染,核染色質(zhì)積聚至核膜周邊,呈現(xiàn)典型凋

5、亡細胞形態(tài)學(xué)改變。流式細胞術(shù)檢測顯示,15、30、45mg·L-1DADS細胞凋亡率分別為5.36±0.87、28.36±3.15、44.58±3.95,顯著高于對照組2.14±0.45(P<0.05)。免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,45mg·L-1DADS處理48h后,Bcl-2表達較未處理細胞表達明顯下調(diào),平均光密度值從0.75±0.06下降至0.34±0.03(P<0.05);Bax表達增強,平均光密度值0.63±0.04高于對照組0.2

6、6±0.03(P<0.05);Caspase3表達增加,平均光密度值0.41±0.05明顯高于未處理組0.19±0.02(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示,45mg·L-1DADS處理U251細胞48h后,Bax和Caspase3蛋白表達均上調(diào),Bcl-2蛋白表達下調(diào)。經(jīng)掃描定量分析,45mg·L-1DADS處理U251細胞48h后Bax蛋白與β-actin平均灰度值比為0.87±0.09,與對照組(0.31±0.04)

7、比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);Bcl-2蛋白與β-actin平均灰度值比為0.47±0.05,與對照組(0.67±0.06)比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Caspase3蛋白與β-actin平均灰度值比為0.41±0.05,與對照組(0.73±0.06)比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、 DADS可呈濃度依賴性抑制惡性膠質(zhì)瘤 U251細胞增殖,并阻滯細胞于G2/M期,可能與cycli