核心巖藻糖基化修飾調(diào)控周細胞參與肺間質(zhì)纖維化的作用機制.pdf

1、肺間質(zhì)纖維化（Pulmonary Fibrosis）是多種肺間質(zhì)性疾病的共同結(jié)局。其發(fā)病率近年呈上升趨勢，其預(yù)后較差，診斷后的平均生存時間不足5年，致死率高，對人民群眾的健康構(gòu)成嚴重威脅，目前缺乏有效的根治措施。因此延緩肺間質(zhì)纖維化進展、降低肺間質(zhì)纖維化發(fā)病率是我國呼吸系統(tǒng)疾病防治所面臨的巨大挑戰(zhàn)和重大需求。
　　盡管間質(zhì)性肺病的病因機制復(fù)雜，肺間質(zhì)纖維化是其不斷進展的共同病理表現(xiàn)與最后通路，主要表現(xiàn)為：炎癥因子聚集，血管塌陷，肌

2、成纖維細胞增多進而產(chǎn)生細胞外基質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致肺臟纖維化、肺功能喪失。目前缺乏有效手段阻止肺間質(zhì)纖維化進展。因此，解析肺間質(zhì)纖維化分子機制，尋求有效的干預(yù)策略，對降低肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病率具有重大的臨床意義。
　　目前，肺間質(zhì)纖維化的詳細分子機制尚不清楚。
　　肺間質(zhì)腔中肌成纖維細胞的大量聚集與肺部血管塌陷是肺間質(zhì)纖維化的核心環(huán)節(jié)和重要因素。目前對于肌成纖維細胞來源尚不明確，爭議較大。國內(nèi)外大量研究顯示其來源主要包括以下幾種途

3、徑：上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)；原位的成纖維細胞的轉(zhuǎn)化及循環(huán)中的前體細胞等。伴隨研究的不斷深入，以往研究的熱點“EMT”觀點因在動物體內(nèi)無法復(fù)制，而受到挑戰(zhàn)。新近有學(xué)者利用遺傳命運圖譜技術(shù)提出在肺間質(zhì)纖維化中周細胞(pericyte)是肌成纖維細胞的主要來源。
　　周細胞活化后的一個重要效應(yīng)是：向肺間質(zhì)腔遷移，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，促進細胞外基質(zhì)合成。周細胞活

4、化后的另一個重要效應(yīng)是：導(dǎo)致肺臟微血管塌陷。由此可見：周細胞活化是導(dǎo)致肺間質(zhì)肌成纖維細胞聚集與肺部微血管塌陷的重要連接點！深入研究周細胞活化機制及其活化后所導(dǎo)致的重要分子效應(yīng)將為肺間質(zhì)纖維化的治療提供新的研究思路和治療策略。
　　周細胞活化的機制是什么目前仍不清楚。相關(guān)研究表明血管內(nèi)皮細胞與周細胞的特殊結(jié)構(gòu)相互分泌的細胞因子如：TGF-β、PDGF配體等進而活化TGF-β、PDGF等通路，最終誘導(dǎo)周細胞轉(zhuǎn)化過程。上述研究表明：多條

5、信號通路的活化是周細胞轉(zhuǎn)化發(fā)生的重要基礎(chǔ)。但是又是什么調(diào)控了這些信號通路的活化？能否找到調(diào)控它們活性的共同靶點？
　　隨著人類基因組計劃的完成以及蛋白質(zhì)組技術(shù)的不斷發(fā)展，糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)成為近幾年研究的熱點。糖蛋白在翻譯后必須借助糖基化修飾完成蛋白質(zhì)功能。核心巖藻糖基化（core fucosylation，CF）是重要的蛋白質(zhì)糖修飾，是由α-1,6核心巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（Fucosyltransferase8，F(xiàn)UT8）催化巖藻糖基由G

6、DP-Fuc轉(zhuǎn)移至糖蛋白N-連接寡糖的核心結(jié)構(gòu)GlcNAc上，形成核心巖藻糖。FUT8是哺乳動物中僅有的一種核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，通過調(diào)控受體蛋白功能來參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　所以我們思考：在肺間質(zhì)纖維化的進程中，多條信號通路的活化是關(guān)鍵，那么CF修飾是否是調(diào)控這些信號通路的共同靶點？
　　然而蛋白質(zhì)CF修飾在肺間質(zhì)疾病領(lǐng)域的研究尚屬空白。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)了TIMP-1在肺、腎間質(zhì)纖維化中的作用及CF調(diào)控腎臟纖維化

7、中TIMP-1。此外，我們課題組的前期實驗及國外文獻報道：調(diào)控周細胞轉(zhuǎn)分化重要通路中的關(guān)鍵受體PDGFβR、TGF-βR均為糖蛋白。
　　上述研究結(jié)果表明CF修飾可能參與周細胞轉(zhuǎn)化，而且在肌成纖維細胞聚集后產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)沉積可能發(fā)揮重要作用，貫穿肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的全過程。
　　我們提出科學(xué)假設(shè)：CF修飾可能是調(diào)控周細胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化進展中的重要靶點，因此以此為靶點進行干預(yù)很可能成為未來治療肺間質(zhì)纖維化的新策略。然而

8、，CF修飾在肺間質(zhì)纖維化進展中的改變是什么？周細胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化中鍵蛋白是什么？是否受CF調(diào)控？干預(yù)CF修飾后是否可以逆轉(zhuǎn)周細胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化的進展？這些都是尚未解決的科學(xué)問題。
　　因此，要解決上述科學(xué)問題，本實驗擬利用體外實驗結(jié)合體內(nèi)實驗，深入研究CF調(diào)控周細胞轉(zhuǎn)化與肺間質(zhì)纖維化的作用機制，這些信息將有利于我們更加清楚的把握CF修飾調(diào)控周細胞轉(zhuǎn)化機制進而解析肺間質(zhì)纖維化，為發(fā)現(xiàn)治療肺間質(zhì)纖維化提供更加精準的靶向藥物。<

9、br>　　因此本課題擬解決“CF修飾是調(diào)控周細胞轉(zhuǎn)化及減輕肺間質(zhì)纖維化的重要調(diào)控點”的觀點，為促進糖生物學(xué)與肺間質(zhì)纖維化相互滲透、治療肺間質(zhì)纖維化提供全新思路與治療策略。
　　第一部分體外小鼠肺臟周細胞的分離與培養(yǎng)
　　目的：
　　建立體外小鼠肺臟周細胞分離及培養(yǎng)方法，明確周細胞的生物學(xué)特征。
　　方法：
　　1利用免疫磁珠方法分離純化小鼠肺臟周細胞,通過倒置相差顯微鏡觀察周細胞的形態(tài)。2利用PDGFβR、

10、α–SMA、CD73、Desmin多種周細胞標志物進行免疫熒光鑒定。3應(yīng)用CCK8方法測定肺臟周細胞生長情況并繪制生長曲線圖。
　　結(jié)果：
　　1免疫磁珠分選小鼠肺臟周細胞約12天左右融合，傳代后生長及融合速度加快；傳代后周細胞生長速度加快，7天左右融合，光鏡下觀察周細胞形態(tài)不規(guī)則,呈星形狀或不規(guī)則形狀。2免疫熒光方法鑒定周細胞多種標記物表達陽性（PDGFβR、CD73、Desmin），生理情況下，α-SMA表達陰性。3細胞

11、生長曲線測定周細胞傳代后（P1）:第4天進入生長對數(shù)期，第8天進入平臺期。
　　結(jié)論：
　　1免疫磁珠分選法可獲得高純度和可傳代的小鼠肺臟周細胞。2選擇原代或者第一代周細胞能夠更好地應(yīng)用周細胞相關(guān)的實驗。
　　第二部分核心巖藻糖基化修飾對周細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的影響
　　目的：
　　觀察阻抑核心巖藻糖基化修飾能否逆轉(zhuǎn)周細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。
　　方法：
　　1體外采用外源性TGF-β1（Tr

12、ansform growth factor-β1，TGF-β1）刺激因子建立周細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化模型，光鏡下觀察48h后周細胞發(fā)生的形態(tài)變化。2利用免疫熒光雙染的方法確定周細胞及肺臟是否表達核心巖藻糖基化修飾及建立體外、體內(nèi)纖維化模型后CF修飾的水平表達變化及周細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化過程中核心巖藻糖基化水平、α-SMA及FUT8的表達變化。3體內(nèi)外分別采用FUT8siRNA及FUT8shRNA技術(shù)沉默周細胞及小鼠肺臟內(nèi)源性FUT8基

13、因，驗證FUT8基因表達。4體內(nèi)研究采用博萊霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化模型，免疫熒光共染方法確定周細胞有無存在遷移及CF對周細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的影響。
　　結(jié)果：
　　1正常周細胞及肺臟存在中等量核心巖藻糖基化水平，體外加入終濃度5ng/mL的TGF-β1孵育周細胞48h后，免疫熒光結(jié)果顯示周細胞及肺臟表面CF表達水平明顯上調(diào)伴隨周細胞轉(zhuǎn)分化全過程。2體外建立周細胞轉(zhuǎn)化模型，免疫熒光結(jié)果顯示周細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，α-SMA的表達上

14、調(diào)；體內(nèi)建立博來霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化模型，免疫熒光及免疫印跡結(jié)果顯示：與正常組相比，肺臟間質(zhì)腔中PDGFR及α-SMA的表達明顯增加（P<0.05）。3 FUT8siRNA瞬時轉(zhuǎn)染周細胞48h后，明顯抑制周細胞轉(zhuǎn)化及上述標記蛋白的表達；腺病毒包裝FUT8shRNA經(jīng)尾靜脈注射后，抑制肺臟肺核心巖藻糖基化修飾水平后，免疫熒光及免疫印跡顯示肺臟α-SMA表達明顯下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1在肺間質(zhì)纖維化模型中，周

15、細胞是肌成纖維細胞的重要來源。2 FUT8催化的核心巖藻糖基化修飾介導(dǎo)了周細胞轉(zhuǎn)分化的全過程，抑制核心巖藻糖基化修飾后可以明顯抑制周細胞轉(zhuǎn)化。
　　第三部分核心巖藻糖基化修飾調(diào)控周細胞轉(zhuǎn)化機制
　　目的：
　　解析在BLM誘導(dǎo)小鼠肺間質(zhì)纖維化模型中，CF調(diào)控周細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的機制及肺間質(zhì)纖維化進程中CF對關(guān)鍵蛋白（PDGFβR、TGF-βRⅠ、p-Erk、p-Smad2/3）蛋白的影響。
　　方法：

16、>　　1利用外源性TGF-β1誘導(dǎo)周細胞轉(zhuǎn)化體外模型及BLM致小鼠肺間質(zhì)纖維化體內(nèi)模型中，應(yīng)用免疫熒光檢測周細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信號通路的活化。2體外 FUT8siRNA技術(shù)及利用腺病毒包裝的FUT8shRNA經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)沉默周細胞及肺臟CF后，通過熒光雙染及免疫沉淀方法檢測PDGFβR、TGF-βRⅠ受體蛋白是否受到核心巖藻糖基化修飾及CF修飾對其PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信

17、號通路中關(guān)鍵蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　1外源性刺激因子TGF-β1（5ng/ml）孵育周細胞48小時后，免疫熒光雙染顯示周細胞轉(zhuǎn)分化關(guān)鍵受體蛋白PDGFR、TGF-βRI顯著升高，其CF修飾水平亦顯著升高；PDGFR、TGF-βRI受到CF修飾，F(xiàn)UT8siRNA阻抑核心巖藻糖基化修飾并不影響受體蛋白的表達。2外源性刺激因子TGF-β1（5ng/ml）孵育周細胞48小時后，PDGF、TGF-β信號通路被激活，免疫熒光方法

18、顯示下游磷酸化蛋白p-Erk、p-Smad2/3表達明顯增加；阻抑核心巖藻糖基化修飾后明顯下調(diào)p-Erk、p-Smad2/3表達。3體內(nèi)建立博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化模型，于28天作為造模終點，激活肺間質(zhì)臟纖維化及周細胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)的TGF-β、PDGF信號通路，免疫熒光雙染、免疫印跡及免疫沉淀顯示肺間質(zhì)纖維化過程中關(guān)鍵蛋白PDGFβR、TGF-βRI表達及CF修飾水平顯著升高，同時受到CF修飾；FUT8shRNA阻抑核心巖藻糖基化修

19、飾并不影響受體蛋白的表達，但明顯抑制下游磷酸化蛋白p-Erk、p-Smad2/3的表達。
　　結(jié)論：
　　1 PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信號通路的活化參與了周細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的全過程。2關(guān)鍵受體蛋白PDGFβR及TGF-βRI受到 CF修飾。3阻抑核心巖藻糖基化修飾明顯抑制PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信號通路中下游磷酸化蛋白的表達,抑制周細胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化的進展。
　　第四部分核

20、心巖藻糖基化在周細胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化進展中的修飾特征
　　目的：
　　探討核心巖藻糖基化修飾在周細胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化進程中的變化特征及阻抑CF修飾后對肺臟病理及細胞外基質(zhì)沉積的保護作用。
　　方法：
　　1利用外源性TGF-β1誘導(dǎo)周細胞轉(zhuǎn)化體外模型及BLM致小鼠肺間質(zhì)纖維化體內(nèi)模型，應(yīng)用免疫熒光共染及免疫印跡方法檢測FUT8與α-SMA蛋白表達變化。2體外利用FUT8siRNA技術(shù)及體內(nèi)利用腺病毒包裝的FU

21、T8shRNA經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)抑制CF修飾后，應(yīng)用免疫熒光共染及免疫印跡方法檢測抑制CF后對FUT8與α-SMA蛋白表達的影響。3體內(nèi)建立博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化模型，于28天作為造模終點，建立肺臟纖維化病理，利用腺病毒包裝的FUT8shRNA經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)，應(yīng)用病理染色及免疫組化方法檢測對CollageⅠ、CollageⅢ的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1在外源性TGF-β1誘導(dǎo)周細胞轉(zhuǎn)化體外模型及博來霉素誘

22、導(dǎo)小鼠肺間質(zhì)纖維化體內(nèi)模型中，F(xiàn)UT8與α-SMA的表達明顯上調(diào)且呈正相關(guān)。2體外FUT8siRNA及體內(nèi)FUT8shRNA技術(shù)抑制CF表達后，逆轉(zhuǎn)了周細胞轉(zhuǎn)化，F(xiàn)UT8及α-SMA表達明顯下調(diào)。3博來霉素建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型后，病理染色顯示肺臟失去原有結(jié)構(gòu)，肺間質(zhì)腔明顯增厚，膠原纖維明顯增加；免疫組化顯示肺臟中CollageⅠ、CollageⅢ表達明顯增加。4 FUT8shRNA阻抑體內(nèi)核心巖藻糖基化修飾后，病理染色顯示肺臟恢復(fù)原