GCPII基因剔除對小鼠腦外傷后氧化應(yīng)激損傷和凋亡的影響.pdf

1、顱腦外傷后遭受原發(fā)打擊的神經(jīng)細(xì)胞快速大量釋放以谷氨酸為主的多種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對未受直接打擊的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生興奮性毒性，是導(dǎo)致腦外傷后繼發(fā)性損傷的重要病理生理機(jī)制。在應(yīng)用外源性藥物治療顱腦外傷屢屢受挫的情況下，如何啟動(dòng)和開發(fā)內(nèi)源性腦保護(hù)機(jī)制成為了研究熱點(diǎn)。基礎(chǔ)研究表明，突觸前膜釋放谷氨酸的同時(shí)，同時(shí)伴有另外一種內(nèi)源性保護(hù)性神經(jīng)遞質(zhì)N-乙酰天冬氨酰谷氨酸（N-acetyl-aspartyl-glutamate，NAAG）的釋放。NAAG選擇

2、性激活突觸前膜上的代謝型谷氨酸受體第II組第3亞型（Group II metabotropic glutamate receptor subtype3，mGluR3）,能夠負(fù)反饋抑制突觸前膜上的谷氨酸進(jìn)一步釋放。然而，突觸間隙內(nèi)的NAAG在釋放后很快被膠質(zhì)細(xì)胞表面的NAAG肽酶水解，失去其保護(hù)作用。研究證明，NAAG肽酶其實(shí)是由谷氨酸羧肽酶（glutamate carboxypeptidase，GCP）II和III兩種活性成分構(gòu)成。其中

3、，GCPII占NAAG肽酶總活性的90％以上，提示NAAG主要由GCPII滅活。因此，抑制GCPII活性有望成為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)的新策略。目前已有多種NAAG肽酶抑制劑被應(yīng)用于顱腦外傷、腦缺血、疼痛、精神分裂癥等疾病動(dòng)物模型，而且被證實(shí)有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：小鼠控制性皮質(zhì)打擊模型的建立和分級。
　　目的：利用精細(xì)顱腦打擊儀制作小鼠腦外傷模型，依據(jù)檢測結(jié)果對打擊程度進(jìn)行分級，建立穩(wěn)定、可重復(fù)的小鼠顱

4、腦外傷模型。
　　方法：將48只雄性C57/BL小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為4組，其中假外傷組1組，外傷組3組。應(yīng)用精細(xì)顱腦撞擊儀制作控制性皮質(zhì)打擊模型。外傷組打擊深度分別設(shè)置為0.5 mm,1.0 mm和1.5 mm；打擊速度設(shè)置為3.0 m/s;打擊持續(xù)時(shí)間180 ms。假外傷組小鼠僅做致傷準(zhǔn)備而不給予打擊。致傷后觀察小鼠基本生命體征，昏迷時(shí)間及神經(jīng)反射情況。傷后24小時(shí)處死小鼠，灌注后取腦，行TUNEL染色，觀察小鼠受傷皮質(zhì)周圍區(qū)

5、域神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況并計(jì)數(shù)；初步建立小鼠不同程度外傷模型的分級。
　　結(jié)果：小鼠顱腦損傷程度與打擊深度成正相關(guān)。隨著打擊深度的增加，皮質(zhì)受損加重，小鼠復(fù)蘇時(shí)間逐漸延長（p<0.01），疼痛反射及翻正反射抑制時(shí)間逐漸延長（p<0.01）。TUNEL檢測顯示假外傷組未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡細(xì)胞；隨著損傷程度的加深，打擊周圍皮質(zhì)內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加。在打擊速度和持續(xù)時(shí)間相同的情況下，打擊深度為0.5 mm時(shí)模擬輕度顱腦損傷；打擊深度為1.0 mm

6、時(shí)模擬中度顱腦外傷；打擊深度為1.5mm時(shí)模擬中度顱腦外傷。
　　結(jié)論：利用精細(xì)顱腦打擊儀能建立穩(wěn)定可靠的控制性皮質(zhì)打擊小鼠模型，并且可根據(jù)打擊深度分級，為更好地研究顱腦外傷的病理生理機(jī)制提供了可靠的模型基礎(chǔ)。
　　第二部分：GCPII基因剔除對小鼠中度腦外傷后氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　目的：在中度顱腦損傷小鼠模型的基礎(chǔ)上，探討GCPII基因剔除對小鼠顱腦外傷后氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　方法：雄性 GCPII基因

7、剔除小鼠及同窩出生的野生型小鼠各36只，隨為野生型假外傷組（WT+Sham）、野生型外傷組（WT+TBI）、基因剔除假外傷組（KO+ Sham）、基因剔除外傷組（KO+ TBI）。應(yīng)用控制性皮質(zhì)打擊儀制作中度顱腦外傷模型。傷后24h處死動(dòng)物并取腦組織，采用分光光度計(jì)法檢測MDA、GSH、SOD、GPx等氧化應(yīng)激標(biāo)記物（n=6/組）；Evans Blue法評估血腦屏障破壞程度，干濕重法檢測腦組織含水量。
　　結(jié)果：顱腦外傷后野生型小

8、鼠腦組織內(nèi)MDA含量明顯升高，GSH含量明顯下降，SOD及GPx活性明顯降低（均 p<0.05，vs WT+Sham）；血腦屏障破壞顯著（p<0.05，vs WT+Sham）；腦組織含水量明顯增加（p<0.05，vs WT+Sham）。GCPII基因剔除小鼠顱腦外傷后也呈現(xiàn)出相似變化（p<0.05，vs KO+Sham），但下降/升高程度均較野生型明顯減輕（p<0.05，vs WT+TBI）。
　　結(jié)論： GCPII基因剔除能顯著

9、增強(qiáng)小鼠對腦外傷后氧化應(yīng)激損傷的耐受性。
　　第三部分：GCPII基因剔除對小鼠腦外傷后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。
　　目的：在中度顱腦損傷小鼠模型的基礎(chǔ)上，探討GCPII基因剔除對小鼠顱腦外傷后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：雄性GCPII基因剔除小鼠及同窩出生的野生型小鼠各24只，隨為野生型假外傷組（WT+Sham）、野生型外傷組（WT+TBI）、基因剔除假外傷組（KO+ Sham）、基因剔除外傷組（KO+ TB

10、I）。應(yīng)用控制性皮質(zhì)打擊儀制作中度顱腦外傷模型。傷后24h處死動(dòng)物并取腦組織，采用Western Blot檢測Bcl-2、Bax、cytochrome c、cleaved caspase-3的表達(dá)含量；采用TUNEL染色法觀察皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況并做統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：顱腦外傷后小鼠損傷周圍皮質(zhì)內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，GCPII基因剔除外傷組小鼠凋亡細(xì)胞數(shù)較野生型外傷組小鼠少（p<0.05）。 Western Blot分析結(jié)果顯示