水蘇堿改善新生大鼠腦組織缺血損傷的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　缺氧缺血性腦病(HIE)是各種原因引起的腦組織缺血、缺氧而導(dǎo)致的腦組織損傷，最常見的是新生兒缺氧缺血性腦病。新生兒缺氧缺血性腦病作為各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停從而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷的一類疾病，是圍產(chǎn)期窒息后常見并發(fā)癥，臨床上常常會(huì)表現(xiàn)出兒童智力、行為障礙等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致新生兒的死亡。
　　迄今為止，關(guān)于新生兒HIE發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前的研究表明，缺氧

2、缺血性腦損傷(HIBD)的發(fā)生是一個(gè)多因素參與介導(dǎo)地綜合性的病理過程。其病理生理可能與能量耗竭、氧自由基、Ca2+過量?jī)?nèi)流、興奮性氨基酸等因素相關(guān)，以上因素相互作用，促使腦細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)破壞甚至死亡。復(fù)雜的病理生理機(jī)制決定了HIE的治療是一個(gè)很復(fù)雜的過程，目前尚缺乏特效療法。如何盡早進(jìn)行正規(guī)的治療和干預(yù)就成為大家一直以來研究的熱點(diǎn)。
　　近年來，很多天然產(chǎn)物因具有神經(jīng)保護(hù)作用可以改善缺血性腦損傷而成為研究的熱點(diǎn)。本研

3、究主要通過水蘇堿抑制組蛋白去乙?；?HDAC)活性來探討水蘇堿在改善新生大鼠腦缺氧缺血性損傷(HIBD)方面的作用及其可能的作用機(jī)制，從而為臨床HIE的診療提供有效的理論依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。
　　研究方法:
　　1、創(chuàng)建動(dòng)物模型
　　選取7日齡(P7)Sprague-Dawley(SD)大鼠共112只，體重(12.1-16.5)g，雌雄不拘，參照Rice及改良法等方法制作新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型，隨機(jī)分為

4、4組:
　　1)正常對(duì)照組(Sham組，n=12);即假手術(shù)組，正常大鼠，僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，掛線不結(jié)扎，不進(jìn)行通混合氣體;
　　2)陰性對(duì)照組(Con組，n=20):HIBD大鼠，給予生理鹽水治療;
　　3)低劑量水蘇堿治療組(L組，n=40):HIBD大鼠，給予水蘇堿腹腔內(nèi)注射，5mg/kg/d;
　　4)高劑量水蘇堿治療組(H組，n=40):HIBD大鼠，給予水蘇堿腹腔內(nèi)注射，10mg/kg/d。
　

5、　以上所有組大鼠均給予為期5天的治療。
　　2、留取新生大鼠腦組織標(biāo)本
　　完成治療方案后12小時(shí)(P12)評(píng)估每只新生大鼠的體重和溫度，將所有的新生大鼠麻醉（苯巴比妥）后，心內(nèi)灌注后取人腦組織。將獲取的各組大腦組織再隨機(jī)分為兩組，其中一組(n=77)冷凍儲(chǔ)存于-70℃液態(tài)氮儲(chǔ)存罐中用于蛋白的評(píng)估，另一組(n=35)制作蠟塊以備進(jìn)行TUNEL染色。
　　3、評(píng)估腦組織的相關(guān)指標(biāo)
　　對(duì)留取的所有大鼠腦組織標(biāo)本進(jìn)行

6、梗死面積、細(xì)胞凋亡、HDAC活性及生化指標(biāo)等方面進(jìn)行檢測(cè)或評(píng)估。具體如下:
　　1)梗死面積的評(píng)估:應(yīng)用2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法，切片后應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算梗死面積;
　　2)細(xì)胞凋亡的評(píng)估:應(yīng)用TUNEL染色法，凋亡陽性細(xì)胞顯色為棕黃色，采用對(duì)腦組織的石蠟切片中隨機(jī)計(jì)算3個(gè)高倍鏡視野中TUNEL染色陽性皮層細(xì)胞占總皮層細(xì)胞百分率的方法（以％表示）;
　　3)HDAC活性的檢測(cè):應(yīng)用比色檢測(cè)法，測(cè)定4

7、05nm處的吸光度，采用與Sham組比較的方法（以％表示）;
　　4)乙酰化H3和H4蛋白表達(dá)水平的檢測(cè):應(yīng)用Westernblot法，應(yīng)用采用與Sham組比較的方法（以％表示）;
　　5)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等細(xì)胞因子的檢測(cè):應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀AU5821測(cè)定新生大鼠腦組織勻漿上清液中各個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平。
　　6)TNF-α、IL-10等細(xì)胞因子的檢測(cè):應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(

8、ELISA)法，測(cè)定新生大鼠腦組織勻漿上清液中各個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　使用SPSS18.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以X±S表示，計(jì)數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)、單因素方差(OnewayANOVA)分析或LSDpost.hoc分析。當(dāng)p＜0.05被認(rèn)為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　研究結(jié)果:
　　1.水蘇堿對(duì)梗死面積的影響
　　Con組大鼠腦組織的梗死面積(224

9、mm2)明顯高于Sham組的(20mm2)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，說明缺氧條件卜大鼠腦組織梗死面積明顯增加。水蘇堿治療組腦梗死面積（L組:89mm2;H組:53mm2）較Con組人鼠顯著降低(p＜0.01)。皮質(zhì)下區(qū)域各組梗死面積變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　2.水蘇堿對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織細(xì)胞凋亡方面的影響
　　Con組大鼠腦組織的細(xì)胞凋亡率為23.8％，明顯高于Sham組的3.

10、5％，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，說明缺氧缺血條件下新生大鼠腦組織細(xì)胞凋亡明顯增加。經(jīng)水蘇堿治療組腦細(xì)胞凋亡率（L組:11.4％;H組:5.6％）較Con組大鼠顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　3.水蘇堿對(duì)HDAC活性的作用
　　水蘇堿可以降低缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織中的HDAC酶的活性，且存在劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。其中，Con組的HDAC活性約為238％，經(jīng)水蘇堿治療后

11、，L組降至179％，而H組下降更明顯至136％。另外，經(jīng)水蘇堿治療組中乙?；鞍譎3和H4在缺血新生大鼠腦組織中的表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　4.水蘇堿對(duì)腦組織中細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響
　　Con組中HIBD新生大鼠腦組織TNF-α水平(169pg/100mg)較sham組(48pg/100mg)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(p＜0.01)。然而，經(jīng)水蘇堿治療后TNF-α表達(dá)水平明顯降低（L組為98

12、pg/100mg，H組為71pg/100mg）(p＜0.01，p＜0.01)。此外，水蘇堿治療后IL-10的表達(dá)水平亦有明顯增加(p＜0.05，p＜0.01)。值得一提的是，研究發(fā)現(xiàn)水蘇堿對(duì)TNF-α和IL-10表達(dá)水平的作用存在劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)意義(p＜0.01，p＜0.01)。
　　5.水蘇堿在氧化應(yīng)激方面的作用
　　Con組HIBD新生大鼠腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)如SOD、GSH-PX等指標(biāo)明顯降低，其中Sham組中

13、SOD及GSH-PX的表達(dá)水平分別為2.67±0.23U/100mg及192.7±8.3U/100mg，而Con組中的表達(dá)水平分別為0.79±0.12U/100mg及96.8±5.9U/100mg，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01，p＜0.01)。但經(jīng)水蘇堿治療后的表達(dá)比Con組顯著增加(p＜0.01，p＜0.01)，SOD及GSH-PX的表達(dá)水平在低劑量組（L組）和高劑量組（H組）分別為1.73±0.19U/100mg及130.6±

14、7.2U/100mg和2.18±0.20U/100mg及169.2±8.1U/100mg。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧缺血可導(dǎo)致新生大鼠腦組織梗死，而經(jīng)水蘇堿治療后腦梗死體積明顯減少，說明水蘇堿能夠改善腦組織的梗死。
　　2.水蘇堿可以通過降低HIBD新生大鼠腦細(xì)胞凋亡率從而改善缺氧缺血導(dǎo)致的腦組織損傷。
　　3.水蘇堿可以降低HIBD大鼠腦組織中的HDAC酶的活性，從而提示水蘇堿可能通過這種方式保護(hù)及改善受損的大

15、鼠腦組織。而且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)水蘇堿對(duì)HDAC活性的抑制作用存在劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)主要研究從水蘇堿改善HIBD大鼠腦組織中乙?；疕3和H4蛋白的高表達(dá)方面來證實(shí)其保護(hù)受損腦組織的可能發(fā)生機(jī)制。
　　4.水蘇堿可以降低HIBD大鼠腦組織損傷導(dǎo)致的細(xì)胞因子如TNF-α高表達(dá)及提高IL-10的表達(dá)，說明水蘇堿在一定程度上可以降低細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞的破壞作用和減少單核-吞噬細(xì)胞功能的抑制作用。另外，同上面的抑制HDAC活性一樣，我們發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞

16、因子的作用也存在劑量依賴性，充分提示水蘇堿可以保護(hù)腦組織減少進(jìn)一步的損傷。
　　5.水蘇堿可以提高氧化應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)指標(biāo)如SOD、GSH-PX的表達(dá)，從而保護(hù)腦細(xì)胞免受內(nèi)源性超氧化物自由基陰離子的毒害作用，這也可能是水蘇堿改善腦損傷的機(jī)制之一。
　　意義
　　本研究證實(shí)了水蘇堿在HIBD大鼠中具有的神經(jīng)保護(hù)作用，其可以明顯改善腦組織的損傷程度，為臨床HIE的診斷及治療提供了很好的思路及理論依據(jù)。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)