健脾益肺Ⅱ號對COPD大鼠骨骼肌萎縮作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.觀察不同時間香煙煙霧對大鼠肺及骨骼肌的影響。
　　2.探討中藥復(fù)方“健脾益肺Ⅱ號”對香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD大鼠骨骼肌萎縮的
　　作用。以及中藥復(fù)方“健脾益肺Ⅱ號(JY-Ⅱ)”通過干預(yù)AMPK/ULK-1信號通路改善COPD大鼠骨骼肌萎縮的機(jī)制。
　　3.通過體外實驗，初步探討“健脾益肺Ⅱ號”改善骨骼肌萎縮的分子作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.96只SD大鼠，采用隨機(jī)對照實驗方法，將大鼠

2、按體重大小排列后，根據(jù)照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組16只。分別為1個月正常組(Con-1m)、1個月模型組(CS-1m)、3個月正常組(Con-3m)、3個月模型組(CS-3m)、6個月正常組(Con-6m)、6個月模型組(CS-6m)。通過不同時間香煙煙霧刺激建立COPD大鼠模型。通過觀察大鼠一般情況、體重及飲水量變化、肺功能及肺組織病理變化、支氣管灌洗液中蛋白含量及超氧化物歧化酶含量、血常規(guī)變化及骨骼肌組織病理及其超微結(jié)構(gòu)改變評估模

3、型建立的情況。通過檢測大鼠骨骼肌自噬相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平觀察香煙對大鼠骨骼肌的影響。
　　2.將45只SD大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組15只。分別為正常組(Con組)、模型組（CS組）以及健脾益肺-Ⅱ號中藥組（JY-Ⅱ組）。除Con組外，CS組與JY-Ⅱ組采用香煙煙霧刺激建立COPD大鼠模型。6個月后，觀察JY-Ⅱ?qū)ο銦煙熿F刺激后大鼠一般情況、體重、飲水量、肺功能、肺組織病理、支氣管灌洗液中蛋白和氧化應(yīng)激指標(biāo)、血常規(guī)變化

4、及骨骼肌自噬相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)情況的影響。
　　3.體外實驗選用大鼠成肌細(xì)胞（L6細(xì)胞系），分別用香煙煙霧提取物(CSE)和JY-Ⅱ復(fù)方干預(yù)L6細(xì)胞，觀察CSE誘導(dǎo)的L6細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Lc3B、Beclin-1、AMPKα、p-AMPKα、ULK等表達(dá)的影響以及JY-Ⅱ干預(yù)后上述蛋白的變化。并應(yīng)用AMPK激動劑(AICAR)和抑制劑(BML275)作用于細(xì)胞，觀察其對上述蛋白的變化。
　　結(jié)果:
　　1.隨著香煙煙

5、霧刺激時間增加，CS組大鼠精神狀態(tài)逐漸變差，皮毛逐漸變黃色，干枯粗糙。飲食逐漸減少。接受香煙煙霧刺激時聚集成堆，蜷縮少動。CS組大鼠體重增長慢于Con組（P＜0.05），隨熏煙時間越長，體重差異一直存在(P＜0.05)。香煙煙霧刺激后，CS組大鼠飲水增多，與Con組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CS組大鼠肺總量高于Con組大鼠(P＜0.05)。且隨著香煙煙霧刺激天數(shù)的增加肺總量越高。在香煙煙霧刺激后第1個月和第3個月，CS組大

6、鼠肺氣道阻力(RI)高于Con組（P＜0.05）。香煙煙霧刺激后第3個月，CS組大鼠FEV0.1/FVC降低，與Con組大鼠比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。光鏡下CS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)逐漸改變，肺泡壁斷裂，融合形成肺大泡，肺泡間隔及肺泡壁增厚。從第3個月開始，CS組大鼠肺泡空白面積較Con組增多（P＜0.05）。香煙煙霧刺激3個月后，Con組大鼠腓腸肌肌肉組織結(jié)構(gòu)正常，CS組肌纖維散在分布，肌纖維面積較正常組減少（P＜0.05）。

7、隨香煙煙霧刺激時間增加，CS組大鼠肌肉纖維面積逐漸縮?。≒＜0.05）。在香煙煙霧刺激3個月后，電鏡下CS組肌纖維排列較整齊，嵴部皺褶少。高倍鏡下可見少量空泡樣病變。隨香煙煙霧刺激時間增加，空泡樣變逐漸增多。3個月時，CS組大鼠血液中白細(xì)胞(WBC)總數(shù)、單核細(xì)胞(MONO)總數(shù)、紅細(xì)胞(RBC)總數(shù)以及血紅蛋白(HGB)含量高于Con組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;6個月時CS組紅細(xì)胞數(shù)量(RBC)以及血紅蛋白數(shù)量(HGB)高于

8、Con組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。香煙煙霧刺激后，CS組大鼠支氣管灌洗液(BALF)蛋白高于Con組大鼠（P＜0.05）。而CS組SOD含量僅在熏煙第1個月與Con組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），血清LDH僅在熏煙第6個月與Con組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。香煙煙霧刺激后，CS組大鼠骨骼肌自噬相關(guān)蛋白Beclin-1與LC3B(尤其是LC3B-Ⅱ)、p-AMPK與ULK-1含量升高（P＜0.05）。香煙煙霧刺激后，

9、CS組大鼠腓腸肌Lc3B mRNA的相對表達(dá)高于Con組(P＜0.05)。
　　2.熏煙6個月之后，JY-Ⅱ組大鼠體重高于CS組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。JY-Ⅱ組大鼠且肺泡空白面積較CS組降低（P＜0.05）。JY-Ⅱ組大鼠腓腸肌肌肉纖維面積較CS組縮小緩慢，散在聚集的數(shù)量也減少(P＜0.05)。電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示JY-Ⅱ組大鼠低倍鏡下肌纖維排列較整齊，Z線清楚，嵴部皺褶消失。高倍鏡下空泡樣變少于CS組。JY-Ⅱ組大鼠血

10、液RBC與HGB以及血清LDH含量較CS組降低（P＜0.05）。JY-Ⅱ大鼠腓腸肌自噬蛋白Lc3B及Lc3B mRNA的相對表達(dá)量較CS組大鼠降低(P＜0.05)。
　　3.大鼠成肌細(xì)胞（L6細(xì)胞系）經(jīng)過不同濃度的香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)24h、48h和72h后，呈現(xiàn)出不同的趨勢。其中10％CSE在24h對L6細(xì)胞有抑制作用（P＜0.05）。L6細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的JY-Ⅱ中藥復(fù)方24h、48h和72h的干預(yù)后，呈現(xiàn)出不同的趨勢

11、。其中在6-10mg/ml的JY-Ⅱ中藥液對L6細(xì)胞有抑制作用;且隨著時間的增加，抑制率也不斷增加，呈時間和劑量的依賴性。1-4mg/ml對L6細(xì)胞有增殖作用。不同濃度CSE均可以提高L6細(xì)胞Lc3B蛋白尤其是Lc3B-Ⅱ表達(dá)(P＜0.05)。在CSE誘導(dǎo)L6細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、p-AMPK以及其下游蛋白(ULK-1)相對含量高于Con組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。JY-Ⅱ組p-AMPK及ULK-1蛋白較CS組

12、明顯降低。
　　結(jié)論:
　　1.香煙煙霧能夠引起SD大鼠COPD肺部及骨骼肌病理改變。
　　2.COPD大鼠存在骨骼肌萎縮，與香煙煙霧激活大鼠自噬蛋白上調(diào)有關(guān)。
　　3.CSE對L6細(xì)胞的增殖作用有抑制性，且呈濃度依賴關(guān)系，濃度越高，抑制性越強(qiáng)。
　　4.CSE能夠激活并上調(diào)L6細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)。
　　5.JY-Ⅱ能夠改善COPD大鼠骨骼肌萎縮，可能是通過下調(diào)AMPK/ULK信號通路，并一定程度上抑