豬肺泡巨噬細胞M1亞型及豬KLF4基因對PRRSV復制影響的初步研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是最早于1987年在美國首次被發(fā)現(xiàn)的一種新型病毒性傳染病，是現(xiàn)今世界上危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的疾病之一。巨噬細胞是一種分布廣泛的免疫細胞，可以根據(jù)內環(huán)境的變化從而極化為不同的類型:經典活化巨噬細胞(M1)，以及替代活化巨噬細胞(M2)。豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophage，PAMs)是PR

2、RSV感染后豬只體內最重要的靶細胞。所以本實驗首先通過建立PAMs體外極化模型，研究PAMs極化對PRRSV感染的影響以及PRRSV感染對PAMs影響的動態(tài)學變化。實驗采用預冷法分離PAMs，并在體外進行培養(yǎng)，分別用LPS/IFN-γ誘導刺激M1型巨噬細胞;用IL-4誘導刺激分化為M2型巨噬細胞。通過半定量PCR分別檢測M1，M2型Marker（M1:IL-1β，IL-12，IL-23和CXCL10; M2:Arg-1，IL-10，PP

3、ARγ和YM-1）表達量的變化，從核酸水平上證明極化模型的成功。同時用Western blotting從蛋白水平上確定M1型，M2型PAMs的極化成功。之后用500TCID50 HuN4-F5株PRRSV感染極化后的PAMs亞型，在感染后的12，24，36和48h分別通過間IFA和Western blotting對PRRSV的感染量進行測定。結果發(fā)現(xiàn)在感染后的12至36h內M1型PAMs中PRRSV的感染量明顯低于正常組和M2型PAMs

4、的感染量，而在感染后的48h時M1組中PRRSV的感染量與正常組和M2型PAMs中的感染量基本一致，無顯著性的差異。
　　然而PAMs主要通過其表面的模式識別受體(pattern recognitionreceptor, PRR)發(fā)揮其天然免疫防御的功能。那么是否PRRSV感染M1型巨噬細胞對其模式識別受體產生了影響，從而M1型巨噬細胞對PRRSV感染在一段時間內產生了抑制。因此我們通過熒光定量PCR的方法對感染PRRSV的M1型

5、巨噬細胞模式識別受體mRNA的表達量進行了測定，并同時對被認為是巨噬細胞極化的關鍵調節(jié)因子的KLF4基因也進行了測定。而在測定結果中我們意外的發(fā)現(xiàn)PRRSV感染極化后M1型巨噬細胞中的KLF4表達量與M1型巨噬細胞對PRRSV復制的影響趨勢相似。結果表明感染PRRSV后，隨著時間的變化M1型巨噬細胞中KLF4的表達量逐漸降低，在12h達到最低，24h后KLF4的表達量逐漸升高，且在感染后48h時KLF4的表達量與正常組的表達量基本一致，

6、無顯著性差異。
　　因此為了進一步研究豬KLF4基因對PRRSV復制的影響，本實驗通過PCR技術擴增得到豬KLF4基因，通過TA克隆構建pMD18-T-KLF4重組質粒。酶切鑒定后將KLF4的cDNA亞克隆至pCMV-HA載體，構建重組質粒pCMV-HA-KLF4。轉染重組質粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145中，12h后感染PRRSV,并在感染后24h通過Western blotting對PRRSV的感染量進行進行測定。