沉默Bmi1基因增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、Bmi1‐siRNA增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性
　　目的：設(shè)計(jì)針對(duì)人的Bmi1-siRNA，轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞后檢測(cè)轉(zhuǎn)染Bmi1-siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞Bmi1基因和蛋白表達(dá)的影響；研究沉默胰腺癌細(xì)胞的Bmi1基因表達(dá)后再經(jīng)不同濃度吉西他處理后的半抑制濃度（IC50），探討沉默胰腺癌細(xì)胞Bmi1基因的表達(dá)對(duì)吉西他濱敏感性的影響。
　　方法：將Bmi1基因的靶向小片段siRNA通過(guò)Lipofectamine200

2、0的介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人的胰腺癌細(xì)胞（Panc-1細(xì)胞系），48小時(shí)后分別用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）檢測(cè)Bmi1 mRNA與蛋白的表達(dá)。用不同濃度的吉西他濱處理轉(zhuǎn)染Bmi1-siRNA的胰腺癌細(xì)胞，48小時(shí)后MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值，然后計(jì)算各組細(xì)胞的IC50(半抑制濃度)。
　　結(jié)果：Bmi1-siRNA組Bmi1基因的表達(dá)較對(duì)照組減少了約3/4；蛋白的表達(dá)減少了約2/3；

3、Bmi1-siRNA組的IC50明顯下降。
　　結(jié)論：Bmi1-siRNA明顯減少了胰腺癌細(xì)胞Bmi1 mRNA及蛋白的表達(dá)；且顯著增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞（Panc-1細(xì)胞系）對(duì)吉西他濱的化療敏感性。
　　第二部分、Bmi1-siRNA促進(jìn)吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的凋亡
　　目的：研究沉默胰腺癌細(xì)胞Bmi1基因的表達(dá)對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：用10umol/L的鹽酸吉西他濱處理胰腺癌細(xì)胞，并設(shè)立實(shí)驗(yàn)

4、對(duì)照組（不加吉西他濱）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry）檢測(cè)空白對(duì)照組、NC-siRNA組、Bmi1-siRNA組在吉西他濱處理48h后的腫瘤細(xì)胞凋亡率和線(xiàn)粒體膜電位。
　　結(jié)果：胰腺癌細(xì)胞Bmi1-siRNA組在吉西他濱處理后細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位較空白對(duì)照組和NC-siRNA組均明顯降低；Bmi1-siRNA組在吉西他濱處理后的腫瘤細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組和NC-siRNA組均明顯升高。
　　結(jié)論：Bmi1-si

5、RNA可以促進(jìn)吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的凋亡。
　　第三部分、Bmi1-siRNA抑制吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的表達(dá)
　　目的：研究 Bmi1-siRNA對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)記性蛋白CD133和CD24的表達(dá)的影響。
　　方法：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry）檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞在未加藥、加吉西他濱處理、轉(zhuǎn)染后再加入吉西他濱處理三組細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記性蛋白 CD133和CD24的

6、表達(dá)。
　　結(jié)果：加吉西他濱處理后的胰腺癌細(xì)胞的CD133和CD24的表達(dá)率較空白組明顯增加；Bmi1-siRNA+Gem（10umol/L）組的胰腺癌細(xì)胞CD133和CD24的表達(dá)率較僅用吉西他濱處理細(xì)胞組明顯下降。
　　結(jié)論：Bmi1-siRNA能夠抑制吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的表達(dá)。
　　第四部分、EMT抑制可能是Bmi1-siRNA增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性的作用機(jī)制之一
　　目的：研究Bmi1

7、-siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞鈣黏蛋白E（E-cadherin）的基因表達(dá)的影響；以及對(duì)鈣黏蛋白E（E-cadherin）、鈣黏蛋白N（N-cadherin）、波形蛋白Vimentin的蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)沉默胰腺癌細(xì)胞Bmi1基因后鈣黏蛋白E（E-cadherin）基因的表達(dá)水平；用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western BIot）檢測(cè)沉默胰腺癌細(xì)胞Bmi1基因后鈣黏蛋白E（E-ca