胃癌來源的exosomes通過調(diào)節(jié)轉移前微環(huán)境促進腹膜轉移的機制研究.pdf

1、目的：
　　我們擬通過細胞實驗和動物實驗研究胃癌來源的exosomes（外泌體）對腹膜轉移前微環(huán)境的調(diào)節(jié)及對腹膜轉移的作用，并對具體機制進行了深入探討，將為胃癌腹膜轉移發(fā)生發(fā)展提供新的視角。
　　方法:
　　本研究采用差速離心法及ExoQuick試劑法提取exosomes，利用電子顯微鏡觀察其形態(tài)，熒光共聚焦顯微鏡及相差顯微鏡觀察exosomes內(nèi)化過程、MMT過程以及粘附狀態(tài)，MTT法測定細胞活力，光學顯微鏡觀察細胞

2、和腹膜形態(tài)，免疫印跡法檢測Flotillin-1、CD9、PARP、Procaspase-3、cleaved-caspase-3、Zo-1、Vimentin、p-ERK、ERK、FN和Actin等蛋白的表達，TUNEL染色原位檢測細胞凋亡。統(tǒng)計學處理:每次實驗重復3次，數(shù)據(jù)以均值±標準差（(x)±s）表示。最終采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、胃癌來源exosomes的鑒

3、定和內(nèi)化。
　　收集胃癌MGC803細胞培養(yǎng)上清，利用差速離心法或ExoQuick-TCTM試劑提取exosomes。電子顯微鏡證實MGC803細胞分泌的exosomes呈現(xiàn)典型的圓形或卵圓形，直徑波動在30nm至100nm之間。免疫印跡實驗檢測exosomes標志蛋白，和來源細胞比較，exosomes高表達Flotillin-1、CD9，而不表達陰性對照蛋白“Calreticulin”（鈣網(wǎng)蛋白），結果與文獻報道一致。利用紅色熒

4、光染料DID標記exosomes，和腹膜間皮細胞（HMrSV5細胞）共同孵育后在熒光共聚焦顯微鏡及相差顯微鏡下記錄exosomes的內(nèi)化狀態(tài)。結果顯示:紅色熒光分散在胞漿中，而對照組未檢測到熒光。這表明，我們成功地從胃癌細胞培養(yǎng)上清中提取了exosomes，且exosomes可被靶細胞有效攝取。
　　2、胃癌來源exosomes通過破壞腹膜間皮屏障、誘導腹膜纖維化而促進胃癌腹膜轉移。
　　選取4-6周齡雄性裸鼠，隨機分為實驗

5、組和對照組，腹腔內(nèi)隔日注射胃癌MGC803細胞分泌的exosomes(50μg/0.5ml PBS)和無菌PBS，1周后處死小鼠，收集腹膜并制成石蠟切片。光學顯微鏡下觀察到，PBS處理組小鼠腹膜表面被覆的間皮層保持完整，而exosomes處理組，小鼠腹膜被廣泛破壞，導致間皮下結締組織不同程度地暴露于腹腔。同時，我們在exosomes處理組看到伴隨著腹膜屏障受損腹膜亦明顯增厚、呈纖維化改變。結果提示，胃癌來源的exosomes在轉移前龕形

6、成中發(fā)揮了重要作用。當小鼠腹腔用exosomes預處理后再注射瘤細胞，轉移瘤結節(jié)總重量較對照組明顯增加。這提示，胃癌來源的exosomes很可能通過破壞間皮屏障、誘導纖維化微環(huán)境而加速腹膜轉移。
　　3、胃癌來源exosomes通過凋亡和MMT促進腹膜間皮細胞損傷。
　　HMrSV5細胞以4000個/孔的密度種在96孔板中，貼壁過夜，加入不同濃度的胃癌MGC803分泌的exosomes作用不同時間點。MTT實驗證實exoso

7、mes以時間和濃度依賴特性引起腹膜間皮細胞損傷。胃癌exosomes處理HMrSV5細胞后，蛋白印跡實驗顯示PARP及caspase-3均存在不同程度的裂解。AnnexinⅤ-PI流式雙染法結果示，和對照組比較，200、400μg/ml exosomes處理組，HMrSV5細胞凋亡比例增加了8.3％和13.8％，進一步證實了exosomes能以濃度依賴方式促進腹膜間皮細胞凋亡。不僅如此，胃癌exosomes同時引起HMrSV5細胞形態(tài)發(fā)

8、生間質(zhì)樣改變，而PBS處理組仍保持鋪路石樣外觀。蛋白印跡實驗證實，給予胃癌exosomes處理后HMrSV5細胞緊密連接蛋白（Zo-1）顯著下調(diào)，而波形蛋白(Vimentin)、基質(zhì)蛋白如纖連蛋白(Fibronectin)和Ⅰ型膠原蛋白(Collogen-Ⅰ)則明顯上調(diào)。免疫熒光染色結果亦顯示，定位于膜周的Zo-1蛋白溶解、減少，而中間纖維Vimentin顯著增加。此外，我們還對exosomes處理過的腹膜進行了TUNEL染色和免疫熒光

9、雙重染色，分別體內(nèi)驗證了胃癌exosomes引起的腹膜間皮細胞凋亡和MMT現(xiàn)象。上述結果表明，胃癌來源的exosomes能同時誘導腹膜間皮細胞凋亡及MMT。
　　4、ERK通路在胃癌來源exosomes促進腹膜間皮細胞損傷中發(fā)揮的作用。
　　免疫印跡實驗檢測到MGC803細胞分泌的exosomes引起HMrSV5細胞ERK通路顯著活化。應用或不應用PD98059（ERK1/2抑制劑，25μM）預處理HMrSV5細胞2小時，流

10、式實驗顯示，exosomes組和PBS組HMrSV5細胞凋亡率無明顯差別。同時，抑制ERK通路后exosomes誘導的HMrSV5細胞形態(tài)變化及Zo-1下調(diào)、Vim上調(diào)都存在部分逆轉。這些結果提示，ERK通路主要參與胃癌exosomes誘導腹膜間皮細胞的MMT過程，對凋亡作用甚微。這也意味著，由同一外界刺激—胃癌exosomes引起的腹膜間皮細胞凋亡和MMT可能是相對獨立的過程，存在不同的信號調(diào)控路徑。
　　5、胃癌來源exoso

11、mes通過誘導腹膜間皮細胞FN沉積而促進腹膜粘附
　　用不同濃度的MGC803細胞分泌的exosomes處理HMrSV5細胞，免疫印跡和免疫熒光實驗檢測纖連蛋白FN的表達變化。結果提示，胃癌exosomes能以濃度依賴方式上調(diào)FN的表達。同時，利用免疫印跡技術檢測到多種胃癌細胞系的整合素integrinα5和integrinβ1均呈高表達狀態(tài)。MGC803細胞分泌的exosomes作用HMrSV5細胞一定時間后，熒光共聚焦顯微鏡及

12、相差顯微鏡記錄胃癌細胞粘附情況，結果顯示，exosomes處理組對比PBS處理組腹膜間皮單層的粘附能力明顯增強。上述結果表明，胃癌來源exosomes很可能通過誘導腹膜間皮細胞FN沉積而促進腹膜粘附。
　　6、ERK/AKT/STAT3通路參與胃癌exosomes誘導的腹膜間皮細胞FN合成
　　MGC803細胞分泌的exosomes處理HMrSV5細胞不同時間點(0、15min、30min、1h、3h、6h、12h)，結果示

13、，ERK及AKT通路呈持續(xù)性活化，而STAT3通路則呈一過性活化。給予ERK抑制劑PD98059(25μM)，AKT抑制劑LY294002(20μM)及STAT3抑制劑Stattic(2μM)預處理2小時，免疫印跡實驗證實胃癌exosomes誘導的FN上調(diào)均被明顯抑制。這些結果提示，ERK/AKT/STAT3通路是胃癌exosomes誘導腹膜間皮細胞FN合成的重要信號通路。
　　結論:
　　1、胃癌exosomes通過破壞間