乳斑缺氧微環(huán)境調控胃癌干細胞樣細胞自我更新能力促進腹膜轉移的機制研究.pdf

1、前言：
　　腹膜轉移是胃癌最常見的轉移形式之一，是導致進展期胃癌根治手術失敗的主要因素。腹膜乳斑為腹膜相關淋巴組織，是腹腔內不成熟的巨噬細胞起源部位。在腹膜轉移過程中，腹腔游離癌細胞優(yōu)先定植在乳斑內部，乳斑的獨特解剖結構和血管分布為腫瘤細胞提供了提供了適宜的缺氧微環(huán)境。我們推測，在胃癌腹膜轉移過程中，乳斑可以通過非特異性細胞毒作用部分清除成熟/衰老的胃癌細胞卻不能清除胃癌干/祖細胞;在乳斑缺氧微環(huán)境下，胃癌干/祖細胞維持了未分化表

2、型并且擁有很強的抗凋亡的能力，這亦有助于解釋胃癌干/祖細胞在傳統(tǒng)腹腔化療后可以生存并且迅速再生成腫瘤，進而導致腹膜轉移。另一方面，乳斑中的巨噬細胞可被腫瘤細胞重塑，形成旁路激活表型的腫瘤相關巨噬細胞，這亦有助于維持胃癌干/祖細胞的未分化表型。
　　目的：
　　確定腫瘤干細胞在轉移灶中所在位置并了解其調控機制是成功治療惡性腫瘤的一個重要的先決條件。現(xiàn)已證實，缺氧微環(huán)境可以通過觸發(fā)胃癌干/祖細胞的適應性轉錄反應，調節(jié)腫瘤干細胞的

3、分化和自我更新能力，并最終促使其向具有更強侵襲能力腫瘤表型發(fā)展。然而，我們仍然需要直接的證據(jù)來證明胃癌干/祖細胞優(yōu)先定植在缺氧的乳斑中，同時缺氧微環(huán)境和HIF調控在維持胃癌干/祖細胞未分化表型過程中的作用機制亦需要進一步闡明。本實驗以腹膜乳斑是胃癌細胞入侵腹膜的門戶這一臨床現(xiàn)象為切入點，以乳斑缺氧微環(huán)境對胃癌干/祖細胞生物學行為的調控為核心研究內容，以新的視角解釋胃癌腹膜轉移的成因，以期能夠完善胃癌腹膜轉移的分子機制，為有效防治胃癌腹膜

4、轉移提供新的思路與靶點，亦為腹腔其它臟器惡性腫瘤腹膜轉移的防治提供依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用免疫組化法檢測HIF-1α、OCT4、Nestin在175例進展期胃癌中的表達情況，利用卡方檢驗分析HIF-1α的表達與胃癌臨床病理特點的關系;采用K-M法及Logrank檢驗分析HIF-1α的表達與胃癌患者預后的關系;利用Kendall及Spearman非參數(shù)檢驗分析HIF-1α與OCT4和HIF-1α的表達水平的相關性。

5、r>　　2、在體外誘導7例從胃癌腹膜轉移灶中原代培養(yǎng)的胃癌細胞株缺氧，利用Western Blot方法檢測缺氧對胃癌細胞中HIF-1α表達的影響;利用Transwell方法檢驗HIF-1α表達對胃癌細胞侵襲能力的影響;利用Western Blot方法檢測HIF-1α表達對胃癌細胞EMT狀態(tài)的影響;利用流式細胞術檢測缺氧對胃癌細胞表面干細胞標志物表達的影響;利用流式細胞術檢測缺氧對胃癌細胞側群細胞亞群比率的影響。
　　3、分選出胃癌

6、細胞側群細胞亞群，利用克隆形成和腫瘤球形成實驗檢測缺氧對胃癌細胞自我更新能力的影響;在第三代腫瘤球中利用免疫熒光共聚焦技術檢測干細胞相關標志物OCT4及Nestin的表達;利用免疫熒光共聚焦技術檢測胃癌干/祖細胞分化相關標志物Mucin5ac及Mucin6的表達。
　　4、在裸鼠腹膜轉移模型中，利用免疫熒光共聚焦技術動態(tài)檢測胃癌干/祖細胞進入乳斑的病理過程;利用免疫熒光共聚焦技術動態(tài)檢測胃癌干/祖細胞與乳斑缺氧區(qū)域的位置關系;利用

7、免疫熒光共聚焦技術動態(tài)檢測胃癌干/祖細胞中OCT4及Nestin與乳斑缺氧區(qū)域的位置關系。
　　5、動物實驗中，在正常裸鼠或乳斑巨噬細胞衰竭裸鼠中腹腔注射正?；蚋蓴_HIF-1α表達的胃癌細胞，通過檢測裸鼠腹腔成瘤率、成瘤個數(shù)、腹水形成率以及形成腹水量體內考察破壞乳斑缺氧區(qū)域或者阻斷乳斑內缺氧信號傳遞情況下，對腹膜轉移的阻遏作用。
　　6、建立持續(xù)性缺氧和間斷性缺氧兩組胃癌細胞體外缺氧模型，利用Western Blot方法檢測

8、不同缺氧模型對胃癌細胞中HIF-1α表達的影響;利用Real-time方法檢測不同缺氧模型對胃癌細胞中缺氧相關基因表達的影響。
　　7、利用劃痕實驗、Transwell等方法檢測不同缺氧模型對胃癌細胞侵襲能力的影響;利用Western Blot、免疫熒光共聚焦方法檢測不同缺氧模型對胃癌細胞EMT狀態(tài)的影響。
　　8、分選出胃癌細胞側群細胞亞群，利用克隆形成和腫瘤球形成實驗檢測不同缺氧模型對胃癌細胞自我更新能力的影響;在第三代

9、腫瘤球中利用免疫熒光共聚焦技術檢測干細胞相關標志物OCT4及Nestin的表達。
　　結果：
　　1、胃癌患者HIF-1α的表達與干細胞標志物、轉移方式及預后密切相關
　　(1)HIF-1α的表達情況與組織分型、Lauren分型及復發(fā)情況密切相關。在組織分型中，HIF-1α表達陽性病例中未分化胃癌占77％，高于陰性表達病例的59.6％(P＜0.05)。在Lauren分型中，HIF-1α表達陽性病例中彌散型胃癌居多占62

10、.3％，陰性表達的病例中腸型胃癌居多占53.5％(P＜0.05)。復發(fā)情況中，HIF-1α表達陽性病例中腹膜轉移病例占34.4％，顯著高于表達陰性病例中復發(fā)的比率16.7％(P＜0.05)。
　　(2)OCT4表達陽性116例(65.2％)，陰性62例(34.8％);NESTIN表達陽性113例(63.5％)陰性65例(36.5％)。相關性分析顯示，在Kendall檢驗中，HIF-1α表達情況與NESTIN表達情況呈顯著正相關，相

11、關系數(shù)為0.6(P＜0.05);與OCT3/4表達情況呈正相關，相關系數(shù)為0.44(P＜0.05)。在Spearman檢驗中，HIF-1α表達情況與NESTIN表達情況呈顯著正相關，相關系數(shù)為0.71(P＜0.05);與OCT4表達情況呈正相關，相關系數(shù)為0.52(P＜0.05)
　　(3)HIF-1α表達不同的病例行K-M生存分析，結果顯示HIF-1α陰性表達病例預后好于陽性表達病例（圖5），Log-Rank檢驗P＜0.05。<

12、br>　　2、缺氧通過上調HIF-1α表達誘導胃癌細胞EMT并增加干細胞比率
　　(1)缺氧培養(yǎng)條件下，缺氧敏感的胃癌腹膜轉移株GC1和GC2明顯上調HIF-1α的表達。GC1和GC2轉染慢病毒載體的HIF-1αshRNA，生物學行為穩(wěn)定后缺氧培養(yǎng)24小時，GC1HIF-1α△和GC2HIF-1α△在缺氧條件下均未上調HIF-1α表達。
　　(2)GC1和GC2細胞在缺氧條件下遷移能力顯著強于常氧條件(2.8-and 2.4

13、-fold increases,respectively;both P＜0.05).相反，GC1HIF-1α△ and GC2HIF-1α△細胞在常氧及缺氧條件下的遷移能力無顯著變化。
　　(3)缺氧條件下GC1和GC2細胞下調上皮細胞標志物E-cad的表達;上調間質細胞標記物α-SMA，GC1和GC2細胞發(fā)生了顯著的EMT轉化。而在GC1HIF-1α△和GC2HIF-1α△細胞中，α-SMA和E-cad的表達無明顯變化。

14、　　(4)缺氧培養(yǎng)條件下，GC1和GC2細胞CD44及Lgr5的表達顯著高于常氧培養(yǎng)(8.7-and 5.1-fold increases for lgr5,both P＜0.05;1.7-and 7.1-fold increases for CD44，P=0.24 and P＜0.05，respectively).而在GC1HIF-1α△和GC2HIF-1α△細胞中，CD44或Lgr5的表達無明顯變化。
　　(5)在常氧條件下，

15、GC1和GC1HIF-1α△均富含verapamil敏感的側群細胞(6.4％ and 3.5％，respectively)。經(jīng)過七天的缺氧培養(yǎng)，GC1細胞的SP亞群顯著增加(for GC1,SP ratio was 6.4±0.54％ in normoxia and 22.46±3.57％ in hypoxia,P＜0.05)。而對于GC2和GC2HIF-1α△細胞，雖然表達高水平的干細胞標志物CD44和Lgr5，但是他們并不富含ver

16、apamil敏感的側群細胞(both＜0.5％，data not shown)。
　　3、缺氧增強胃癌干細胞樣細胞自我更新能力，抑制多向分化能力
　　(1)在缺氧條件下GC1sp細胞的克隆形成能力顯著增強(31±3.6vs.13.7±2.1，P＜0.05)。然而GC1HIF-1α△細胞的SP亞群在常氧或缺氧條件下克隆形成能力無明顯變化（5.3±0.5vs.5.1±2.1）。
　　(2)GC1細胞SP亞群可以在缺氧條件下

17、連續(xù)三代形成腫瘤球，并且腫瘤球形成率逐漸增加。GC1細胞SP亞群可以在常氧條件下腫瘤球形成能力并無明顯變化。GC1HIF-1α△細胞的SP亞群在常氧或缺氧條件下腫瘤球形成能力亦無明顯變化。
　　(3)缺氧培養(yǎng)的GC1細胞SP亞群第三代腫瘤球中，HIF-1α的表達顯著高于其他三組，各組腫瘤球中均存在HIF-1α高表達亞群，缺氧培養(yǎng)的GC1細胞的SP亞群第三代腫瘤球中該亞群細胞比率顯著高于其他各組。OCT3/4表達定位于細胞核，缺氧培

18、養(yǎng)的GC1細胞SP亞群第三代腫瘤球中其表達顯著高于其他三組，且與HIF-1α存在共定位關系;Nestin表達定位于細胞膜，缺氧培養(yǎng)的GC1細胞SP亞群第三代腫瘤球中其表達顯著高于其他三組，與HIF-1α存在共定位關系;GC1細胞的SP亞群第三代腫瘤球中，存在另外一群高表達OCT3/4但低表達HIF-1α的亞群，其他三組未發(fā)現(xiàn)該群細胞。
　　(4)缺氧培養(yǎng)的GC1細胞SP亞群第三代腫瘤球中，HIF-1α的表達顯著高于其他三組。Muc

19、in5ac及Mucin6表達定位于細胞質，缺氧培養(yǎng)的GC1細胞的SP亞群第三代腫瘤球中的表達顯著低于其他三組，與HIF-1α不存在共定位關系，高表達HIF-1α的細胞不表達Mucin5ac及Mucin6，三組中均存在另外一群高表達Mucin5ac及Mucin6但低表達HIF-1α的亞群。
　　4、胃癌腹膜轉移過程中乳斑呈現(xiàn)缺氧微環(huán)境
　　(1)胃癌干細胞樣細胞進入腹膜乳斑一周后，開始克隆性增生，乳斑邊界模糊不清但尚可分辨;2

20、周后，胃癌干細胞樣細胞占據(jù)乳斑原有位置，進入快速增值階段，周圍大量巨噬細胞浸潤，乳斑原有結構遭到破壞;乳斑內部胃癌干細胞樣細胞的增殖速率遠高于非乳斑區(qū)域的胃癌干細胞樣細胞。
　　(2)缺氧區(qū)域主要集中在乳斑密集的部位，而且呈帶狀環(huán)形包繞著乳斑，胃癌干細胞樣細胞主要定植在乳斑帶狀缺氧區(qū)域的內部及邊緣，與缺氧區(qū)域有較多重合;乳斑巨噬細胞則主要位于帶狀缺氧區(qū)域的邊緣，與缺氧區(qū)域重合不多。
　　(3)在缺氧區(qū)域中，胃癌干細胞樣細胞高

21、表達干細胞標志物OCT4和Nestin;在非缺氧區(qū)域，胃癌干細胞樣細胞幾乎不表達干細胞標志物OCT4和Nesfin。
　　5、破壞乳斑缺氧微環(huán)境可以抑制胃癌干細胞樣細胞的腹膜轉移
　　(1)經(jīng)過9天（共三次）的clodronate liposomes作用后，裸鼠乳斑面積顯著減小，單個乳斑內巨噬細胞數(shù)量亦顯著減少。
　　(2)正常裸鼠注射GC1細胞的SP亞群后腹膜轉移情況最嚴重;乳斑巨噬細胞耗竭裸鼠注射GC1HIF-1α

22、△細胞的SP亞群后腹膜轉移情況最輕微。注射GC1HIF-1α△細胞的SP亞群的乳斑巨噬細胞耗竭裸鼠比注射GC1細胞的SP亞群的乳斑巨噬細胞耗竭裸鼠腹膜轉移情況顯著減輕;注射GC1HIF-1α△細胞的SP亞群的正常竭裸鼠比注射GC1細胞的SP亞群的正常裸鼠腹膜轉移情況亦顯著減輕。
　　6、不同缺氧模型對SGC-7901細胞缺氧及缺氧相關蛋白/基因表達的影響
　　(1)缺氧48小時后，HIF-1α開始表達于持續(xù)缺氧和間斷缺氧的S

23、GC-7901細胞，間斷缺氧的SGC-7901細胞HIF-1α的表達高于持續(xù)缺氧的SGC-7901細胞;HIF-1α的表達在168小時后達到最大值。間斷缺氧的SGC-7901細胞HIF-1α的表達多位于細胞核內及核周;持續(xù)缺氧的SGC-7901細胞HIF-1α的表達多位于胞漿。
　　(2)在兩組胃癌細胞缺氧模型中，缺氧相關基因HIF-1α、CA9、GLUT-1以及干細胞相關基因OCT4、Nanog的表達均顯著上調(allP＜0.0

24、5);HIF-1α、CA9、Nanog基因在持續(xù)缺氧和間斷性缺氧兩組模型之間的表達無顯著性差異(allP＞0.05);間斷性缺氧模型中GLUT-1、OCT4的表達顯著高于持續(xù)性缺氧模型(bothP＜0.05)。
　　7、不同缺氧模型對SGC-7901細胞遷移，侵襲能力的影響
　　(1)在兩組胃癌細胞缺氧模型中，SGC-7901細胞的遷移能力均顯著增強(1.7 and 1.9 times as large，respective

25、ly;both P＜0.05);兩組胃癌細胞缺氧模型間SGC-7901細胞的遷移能力相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)在兩組胃癌細胞缺氧模型中，SGC-7901細胞的遷移能力均顯著增強(2.0 and 3.3 folds，respectively，P＜0.05);間斷性缺氧的SGC-7901細胞侵襲能力強于持續(xù)性缺氧的SGC-7901細胞(1.6-fold increase，P＜0.05)。
　　(2)在兩組胃癌細胞缺氧模型中，SG

26、C-7901細胞上調上皮細胞特異性標志物E-cadherin蛋白的表達;下調間質細胞特異性標志物α-SMA蛋白的表達。在兩組胃癌細胞缺氧模型中，SGC-7901細胞上調上皮細胞特異性標志物E-cadherin的表達;下調間質細胞特異性標志物α-SMA蛋白的表達。
　　8、不同缺氧模型對SGC-7901細胞干細胞特性的影響
　　(1)在兩組胃癌細胞缺氧模型中，缺氧胃癌干細胞樣細胞的克隆形成能力均顯著增強(37±6.9 and

27、35±6.2 vs.13.7±2.7，respectively;both P＜0.05);間斷性缺氧模型中胃癌干細胞樣細胞的侵襲能力顯著強于持續(xù)性缺氧中胃癌干細胞樣細胞的侵襲能力(1.6-fold increase，P＜0.05)。缺氧SGC-7901的側群細胞亞群均顯著增加(20.8±2.2％ vs.14.7±1.5％ and 3.5±0.3％，respectively;both P＜0.05);間斷性缺氧模型中SGC-7901細胞側

28、群細胞亞群顯著高于持續(xù)性缺氧SGC-7901細胞側群細胞亞群(1.4-fold increase，P＜0.05)。
　　(2)缺氧培養(yǎng)腫瘤球中，HIF-1α的表達顯著高于正常培養(yǎng)的腫瘤球。OCT4表達定位于細胞核，缺氧培養(yǎng)的腫瘤球中其表達顯著高于正常培養(yǎng)的腫瘤球，且與HIF-1α存在共定位關系;Nestin表達定位于細胞膜，缺氧培養(yǎng)的腫瘤球中其表達顯著高于正常培養(yǎng)的腫瘤球，且與HIF-1α存在共定位關系。
　　結論：

29、　　1、HIF-1α廣泛表達于胃癌原發(fā)灶及轉移灶中，對胃癌生物學行為產(chǎn)生重要影響。
　　2、HIF-1α陽性表達是影響胃癌預后的獨立危險因素。
　　3、HIF-1α陽性表達與某些腫瘤干細胞標志物OCT4及Nestin的表達呈正相關，參與了缺氧微環(huán)境對胃癌干細胞樣細胞生物學行為的調控。
　　4、缺氧微環(huán)境下HIF-1α調控胃癌干細胞樣細胞，增強其自我更新能力，減弱其多向分化能力。
　　5、腹膜乳斑是適合胃癌干細胞樣