2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  現(xiàn)有研究表明卵巢癌來源的外泌體(Ovarian Cancer Derived Exosomes,OCDE),包括卵巢癌病人腹水來源的外泌體(Ovarian Cancer Ascites Derived Exosomes,ADE)和卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清的外泌體(Ovarian Cancer Cells Derived Exosomes,CDE),在卵巢癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而,OCDE能否促進(jìn)卵巢癌發(fā)生EMT及活化網(wǎng)膜轉(zhuǎn)

2、移前微環(huán)境目前還沒有報(bào)道。本研究的目的是探討ADE對(duì)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響;探索OCDE對(duì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移前微環(huán)境活化的作用及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響;并探討OCDE傳遞關(guān)鍵miRNA促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞EMT和網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移前微環(huán)境活化,最終促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。
  方法:
  1.超速離心法提取SKOV3、HO8910細(xì)胞和2#、3#腹水外泌體并對(duì)

3、其進(jìn)行鑒定,包括:電鏡觀察OCDE的形態(tài)大??;Western檢測(cè)OCDE標(biāo)記蛋白的表達(dá);DLS(Dynamic Light Scattering)和NTA(Nano particle tracking analysis)檢測(cè)粒徑;流式檢測(cè)表面標(biāo)記蛋白的表達(dá);免疫熒光法檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)OCDE的攝取。
  2.Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、EDU和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)7#ADE對(duì)A2780、SKOV3、ES2細(xì)胞遷移、侵襲、增

4、殖能力的影響;Western blot、免疫熒光檢測(cè)7#ADE處理后A2780、CAOV3、ES2、SKOV3細(xì)胞EMT標(biāo)記物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的改變;
  3.檢測(cè)7#ADE對(duì)原代培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞遷移、增殖及EMT的影響;
  4.小動(dòng)物活體成像在體檢測(cè)腹腔注射7#ADE對(duì)卵巢癌裸鼠原位移植瘤轉(zhuǎn)移的影響,免疫組化檢測(cè)裸鼠瘤組織中的EMT標(biāo)記物的表達(dá)改變。
  5.免疫組化

5、檢測(cè)卵巢癌病人網(wǎng)膜組織標(biāo)本中CAFs和ADSCs的活化指標(biāo)α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá),驗(yàn)證轉(zhuǎn)移前大網(wǎng)膜微環(huán)境活化的存在;
  6.體外提取未發(fā)生轉(zhuǎn)移網(wǎng)膜組織中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer-Associated Fibroblast,CAFs)和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)。OCDE體外分別刺激CAFs和ADSCs,western blot和免疫

6、熒光檢測(cè)α-SMA的表達(dá),設(shè)立時(shí)間梯度和濃度梯度;
  7.未荷瘤裸鼠腹腔注射27#ADE,免疫組化檢測(cè)裸鼠網(wǎng)膜α-SMA的表達(dá);
  8.先腹腔注射27#ADE再建立裸鼠原位移植瘤模型,活體成像觀察外泌體對(duì)卵巢癌轉(zhuǎn)移的影響,免疫組化檢測(cè)裸鼠網(wǎng)膜組織中α-SMA的表達(dá)改變;
  9.生物信息學(xué)分析卵巢癌細(xì)胞外泌體芯片結(jié)果,分析不同轉(zhuǎn)移性CDE中表達(dá)有顯著差異的miRNA;
  10.RT-PCR驗(yàn)證卵巢癌細(xì)胞及其

7、外泌體、OCDE處理后癌細(xì)胞、CAF和ADSCs中差異miRNA的表達(dá),確定OCDE傳遞的miRNA;
  11.RT-PCR檢測(cè)ADE中miR-6780b-5p的表達(dá),并分析其與卵巢癌網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的關(guān)系;
  12.不同miR-6780b-5p含量的四種腹水外泌體刺激CAOV3細(xì)胞,Western blot檢測(cè)EMT標(biāo)記物的改變;利用agomir和antagomir分別上下調(diào)卵巢癌細(xì)胞CAOV3中miR-6780b-5p的表達(dá)

8、,Western blot、免疫熒光檢測(cè)EMT標(biāo)記物的改變。
  結(jié)果:
  1.OCDE在電鏡下呈類圓形雙層立體膜性囊泡,OCDE粒徑大約在50-140nm之間。OCDE均不同程度的高表達(dá)陽性標(biāo)記蛋白CD63、CD9。并且卵巢癌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞均能攝取OCDE。
  2.ADE在體外能促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。ADE處理后,癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少,而N-cadherin、Vimentin表

9、達(dá)增高。
  3.ADE在體外能促進(jìn)原代卵巢癌細(xì)胞的遷移和增殖,且ADE處理后,原代癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少,而N-cadherin、Vimentin表達(dá)增高。
  4.裸鼠原位移植瘤模型中,ADE腹腔注射處理能夠在體促進(jìn)卵巢癌原位瘤的轉(zhuǎn)移,原位瘤組織中E-cadherin表達(dá)降低,而N-cadherin、Vimentin表達(dá)增高。
  5.未發(fā)生網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢癌病人大網(wǎng)膜組織中,可以發(fā)現(xiàn)α-SMA陽性的細(xì)胞

10、。有網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的病人大網(wǎng)膜組織中α-SMA的表達(dá)比無轉(zhuǎn)移的表達(dá)更高。
  6.OCDE體外刺激CAFs和ADSCs后,兩種網(wǎng)膜微環(huán)境原代培養(yǎng)細(xì)胞的活化指標(biāo)α-SMA、FAP的表達(dá)顯著增加。
  7.未荷瘤裸鼠腹腔注射ADE后,在第2周網(wǎng)膜出現(xiàn)少量α-SMA陽性細(xì)胞,第4周α-SMA的表達(dá)顯著增加,且α-SMA表達(dá)隨著ADE刺激的時(shí)間逐漸增加。
  8.ADE顯著促進(jìn)裸鼠原位移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移,外泌體處理組裸鼠網(wǎng)膜中α-S

11、MA表達(dá)明顯更高。
  9.共有七種miRNA在高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞SKOV3-ip1、HEYA8中比低轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞A2780高。
  10.七種miRNA中有四種miRNA在卵巢癌細(xì)胞及其外泌體中表達(dá)豐度高。OCDE處理后,miR-6780b-5p在效應(yīng)細(xì)胞中顯著增加。
  11.miR-6780b-5p在卵巢癌病人腹水外泌體中均有不同程度的表達(dá),且miR-6780b-5p的表達(dá)與網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移有關(guān)。
  12.不

12、同含量miR-6780b-5p的ADE處理癌細(xì)胞后,miR-6780b-5p含量越高,E-cadherin減少,N-cadherin、Vimentin增加的程度越高。上調(diào)CAOV3細(xì)胞miR-6780b-5p后,E-cadherin表達(dá)減少,N-cadherin、Vimentin表達(dá)增加,而下調(diào)miR-6780b-5p后,E-cadherin表達(dá)增加,N-cadherin、Vimentin表達(dá)減少。
  結(jié)論:
  OCDE

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