格爾德霉素衍生物17-DMAG聯(lián)合順鉑對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3及SKOV3-DDP耐藥性影響的研究.pdf

1、目的:卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤，為婦科惡性腫瘤的首要死亡原因。由于卵巢癌早期癥狀隱匿，75％的病人在確診時已為晚期。目前臨床上卵巢癌的治療方法，是卵巢腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及術(shù)后鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。卵巢癌的5年生存率仍徘徊在30％左右。對化療藥物耐藥是卵巢癌患者預(yù)后差，死亡率高的重要原因之一，其中以鉑類耐藥最為常見。鉑類耐藥對于卵巢癌患者的治療非常棘手。因此，現(xiàn)在急需探究改善卵巢癌細(xì)胞對鉑類藥物耐藥的機(jī)制，籍以研發(fā)新的抗癌藥物。Hsp90

2、是人體內(nèi)一種必不可少的分子伴侶蛋白，可通過對其下游近150余種信號蛋白的調(diào)節(jié)，調(diào)控著細(xì)胞周期，腫瘤的發(fā)生及細(xì)胞的凋亡[10]。所以抑制hsp90的功能，導(dǎo)致其不能與客戶蛋白正常結(jié)合，并誘導(dǎo)其底物的降解，阻斷細(xì)胞信號傳導(dǎo)，可以達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。17-二甲基胺乙基-17-去甲氧基格爾德霉素（17-DMAG）是一種特異性的Hsp90抑制劑。有研究表明，17-DMAG通過抑制Hsp90的功能，使survivin，livin的表達(dá)下調(diào)，

3、同時通過誘導(dǎo)STAT信號的傳導(dǎo)及突變p53誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[6]。JhaveriK的研究表明17-DMAG對卵巢癌，宮頸癌，乳腺癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用[28]。相關(guān)研究表明17-DMAG不能下調(diào)hsp90的水平，但是可引起AKT，Met及HER-2在卵巢癌細(xì)胞中的下降[29][30]。17-DMAG對順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)機(jī)制尚無研究。本研究旨在探討17-DMAG與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3及對順鉑耐藥的

4、卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP耐藥性的影響及其相關(guān)機(jī)制，為卵巢癌耐藥機(jī)制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.MTT法檢測17-DMAG（1，2，4，8，16，32μmol/L），順鉑(1，2，4，8，16μg/mL)和17-DMAG與順鉑聯(lián)合作用對SKOV3及對SKOV3/DDP的增殖抑制作用，并計(jì)算17-DMAG聯(lián)合順鉑應(yīng)用逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的耐藥倍數(shù)RF。
　　 2.FCM法測定順鉑，17-DMAG及17-

5、DMAG聯(lián)合順鉑處理SKOV3及SKOV3/DDP后的凋亡率，并通過金氏公式計(jì)算兩藥聯(lián)合作用時的相互作用指數(shù)q值。
　　 3.RT-PCR法檢測順鉑，17-DMAG及17-DMAG聯(lián)合順鉑處理SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞前，后基因hsp90α，p53，bcl-2和survivin基因的表達(dá)情況。
　　 4.Western-blot法檢測順鉑，17-DMAG及17-DMAG聯(lián)合順鉑處理SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)

6、胞前、后細(xì)胞內(nèi)hsp90α，p53，bcl-2和survivin蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.17-DMAG(1,2,4,8,16,32μmol/L)對SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞有顯著的增殖抑制作用，但是，17-DMAG對這兩種細(xì)胞的增殖抑制作用無明顯差別（P＞0.05）;并且隨著17-DMAG用藥濃度的增加，作用時間的延長，其對SKOV3及SKOV3/DDP的增殖抑制作用增強(qiáng)，呈時間劑量依賴性。不同

7、濃度順鉑(1，2，4，8，16μg/mL)分別處理SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞24h，48h，72h后，對這兩種卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用呈一定的劑量-時間依賴關(guān)系，順鉑對SKOV3細(xì)胞的抑制作用較SKOV3/DDP細(xì)胞明顯。17-DMAG聯(lián)合順鉑對SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，呈劑量-時間依賴性。而且，17-DMAG聯(lián)合順鉑逆轉(zhuǎn)順鉑的耐藥倍數(shù)為2.19，表明17-DMAG可逆轉(zhuǎn)順鉑的耐藥性。
　　

8、 2.通過FCM法測得以下藥物處理濃度時的凋亡率，SKOV3細(xì)胞:空白對照組，6μmol/L17-DMAG單藥組，1.5μg/mL順鉑單藥組，17-DMAG與順鉑聯(lián)用組:6μmol/L17-DMAG+1.5μg/mL順鉑。SKOV3/DDP細(xì)胞:對照組，17-DMAG單藥組6μmol/L，細(xì)胞順鉑單藥組3μg/mL，17-DMAG與順鉑聯(lián)用組:17-DMAG6μmol/L+順鉑3μg/mL。采用金氏公式計(jì)算得在skov3細(xì)胞兩藥聯(lián)合作用

9、時的相互作用指數(shù)q=0.941，在SKOV3/DDP細(xì)胞兩藥聯(lián)合作用時的相互作用指數(shù)q=0.999，均高于0.85.說明17-DMAG和順鉑兩藥聯(lián)合應(yīng)用對SKOV3細(xì)胞及SKOV3/DDP細(xì)胞有協(xié)同的增殖抑制效應(yīng)。
　　 3.經(jīng)過17-DMAG和順鉑兩藥單獨(dú)或聯(lián)合處理48h后，采用RT-PCR法檢測SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中hsp90α，p53，bcl-2和survivinmRNA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示:hsp90α在經(jīng)

10、過17-DMAG及順鉑作用后，其含量與對照組比較無明顯差異（P＞0.05）。順鉑作用于SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞48h后，各組的p53，bcl-2和survivin表達(dá)均明顯上升，與空白對照組相比差異有顯著性（P＜0.05），17-DMAG單藥及17-DMAG與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可下調(diào)p53，bcl-2和survivin基因的表達(dá)，與空白對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，且17-DMAG聯(lián)合順鉑組p53，bcl-2和surviv

11、in的下調(diào)與單藥17-DMAG組相比無顯著性差異(P＜0.05)。及SKOV3/DDP細(xì)胞空白對照組p53，bcl-2和survivinmRNA水平高于SKOV3細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.Western-blot法檢測hsp90α，p53，bcl-2和survivin蛋白在SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中的變化，結(jié)果顯示:SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞經(jīng)過17-DMAG及順鉑作用后，hsp90α

12、，bcl-2和survivin蛋白的表達(dá)含量與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）;SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞經(jīng)順鉑作用48h后，兩組的p53蛋白表達(dá)增加，與對照組比有顯著性差異(P＜0.05)，17-DMAG單藥組及17-DMAG聯(lián)合順鉑組均下調(diào)p53蛋白的表達(dá)，與空白對照組相比有顯著差異（P＜0.05），但是17-DMAG單藥組下調(diào)p53蛋白的表達(dá)與17-DMAG同順鉑聯(lián)用組相比無顯著性差異(P＞0.05)。SKOV3及SK

13、OV3/DDP細(xì)胞空白對照組間p53，bcl-2和survivin蛋白水平相比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.17-DMAG聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用，且呈時間劑量依賴性。17-DMAG與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對兩種卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用均明顯強(qiáng)于17-DMAG及順鉑的單獨(dú)使用。
　　 2.17-DMAG聯(lián)合順鉑可下調(diào)SKOV3和SKOV3/