醛縮酶 A 作為肝癌治療新靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究及活性當(dāng)歸多糖的篩選.pdf

1、背景：
　　作為嚴(yán)重危害人民健康的重大疾病之一，惡性腫瘤在我國諸多疾病中導(dǎo)致了最高的人口死亡率。相較于機(jī)體正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞所特有的生長代謝模式，為其提供了極大的生存和侵襲優(yōu)勢，使得腫瘤細(xì)胞對人類健康危害巨大且令人束手無策。早在1927年，Warburg等就觀察到，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞往往能通過糖酵解途徑代謝更多的糖并產(chǎn)生大量乳酸。醛縮酶 A（EC4.1.2.13，ALDOA）是糖酵解和糖異生途徑中的一個(gè)重要代謝酶，從而調(diào)控機(jī)

2、體能量代謝過程?，F(xiàn)有研究提示，ALDOA在諸多癌癥中過表達(dá)，如鱗狀細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌，部分腫瘤病人血清中 ALDOA表達(dá)明顯增高，表明ALDOA可能是腫瘤發(fā)展和惡變的關(guān)鍵分子。ALDOA不僅在糖酵解中起著重要作用，還參與到細(xì)胞其他功能中，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞運(yùn)動等。但目前 ALDOA與肝癌發(fā)展的關(guān)系尚不清楚，其能否成為肝癌診斷指標(biāo)、其抑制劑能否成為抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的候選化合物，還有待于證實(shí)。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)：ALDOA能促進(jìn)

3、肝癌的轉(zhuǎn)移，同時(shí)多糖能影響肝癌細(xì)胞ALDOA的表達(dá)，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)工作。
　　目的：
　　本課題擬采用藥理學(xué)和基因干預(yù)（病毒感染）相結(jié)合的手段，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)和相關(guān)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，從分子、細(xì)胞和整體動物水平明確 ALDOA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步篩選以 ALDOA為治療靶點(diǎn)的抗腫瘤當(dāng)歸多糖，初步建立以ALDOA為靶點(diǎn)的新藥篩選模型。
　　方法：
　　（1）選取臨床肝癌樣本組織芯片，應(yīng)用免疫組織

4、化學(xué)法（IHC）檢測 ALDOA在人肝癌組織樣本中的蛋白表達(dá)，分析其與癌旁組織相比 ALDOA表達(dá)的變化；并同時(shí)檢測了腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（ E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）在人肝癌組織樣本中的表達(dá)，并運(yùn)用Spearman相關(guān)性分析法分析其相關(guān)性。（2）肝癌細(xì)胞株篩選，檢測不同肝癌細(xì)胞株中 ALDOA表達(dá)，其中 HepG2細(xì)胞在給予高糖刺激后ALDOA表達(dá)變化最為顯著；建立ALDOA RNA干擾與過表達(dá)

5、HepG2肝癌細(xì)胞模型，并用Realtime PCR和蛋白免疫印跡法（WB）檢測重組細(xì)胞ALDOA在mRNA水平以及蛋白水平表達(dá)差異，驗(yàn)證過表達(dá)和RNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（3）觀察 ALDOA對腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖能力的影響，對四株重組細(xì)胞HepG2-ALDOA-NC，HepG2-ALDOA，HepG2-shRNA-NC，HepG2-shRNA-ALDOA通過免疫熒光法（IF）和 WB檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)變化；T

6、ranswell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移；通過裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)，繪制腫瘤生長曲線；裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，處死裸鼠后觀察肝癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移后肺部組織病變情況；進(jìn)行了細(xì)胞生長曲線的測定，流式細(xì)胞儀測凋亡。（4）篩選以ALDOA為治療靶點(diǎn)的抗腫瘤當(dāng)歸多糖，不同當(dāng)歸多糖組分分別作用HepG2細(xì)胞，通過WB檢測細(xì)胞內(nèi)ALDOA蛋白水平表達(dá)差異，同時(shí)觀察當(dāng)歸多糖對HepG2細(xì)胞增殖的影響；通過HepG2-ALDOA細(xì)胞明確活性多糖對ALD

7、OA的特異性作用。
　　結(jié)果：
　?。?）在人肝癌組織樣本中，與癌旁組織相比，ALDOA在肝癌組織中的表達(dá)顯著增加，Vimentin與E-cadherin的表達(dá)也發(fā)生了變化；相關(guān)性分析結(jié)果顯示ALDOA和Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)，但ALDOA和E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。（2）成功構(gòu)建了ALDOA過表達(dá)和RNA干擾重組細(xì)胞模型。（3）構(gòu)建完成的AIDOA過表達(dá)細(xì)胞與對照細(xì)胞相比，細(xì)胞中Vimentin與E-ca

8、dherin的表達(dá)發(fā)生了變化，結(jié)果與組織芯片 IHC一致；ALDOA過表達(dá)細(xì)胞的體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力與成瘤能力均有所增強(qiáng)；其增殖能力、抗凋亡能力，以及細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)。RNA干擾重組細(xì)胞與對照細(xì)胞相比，細(xì)胞中Vimentin與E-cadherin的表達(dá)也同樣發(fā)生了變化；RNA干擾重組細(xì)胞的體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力與成瘤能力有所降低；其增殖能力、抗凋亡能力，以及細(xì)胞遷移能力相對減弱。（4）當(dāng)歸多糖組分AAPS-2II能明顯抑制HepG2-ALDOA肝