肝癌干細(xì)胞新型培養(yǎng)體系的建立以及治療靶點(diǎn)篩選.pdf

1、腫瘤干細(xì)胞的存在已經(jīng)被越來(lái)越多的人所認(rèn)同，但由于分離到的CSCs細(xì)胞數(shù)量太少，難以支持后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。如何在體外有效的分離，培養(yǎng)，擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞，并以此為研究對(duì)象是我們思考的方向。國(guó)外學(xué)者在長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn)，加入EGF和bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)液有利于正常成體干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，并維持干細(xì)胞多向分化潛能。目前已經(jīng)在乳腺癌、惡性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中分離培養(yǎng)得到了類(lèi)似腫瘤干細(xì)胞的一群細(xì)胞，他們是用含有EGF和bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)體系維持

2、增殖、分化潛能。我們將以此為基礎(chǔ)進(jìn)行肝癌干細(xì)胞的培養(yǎng)。由于現(xiàn)階段分離肝癌干細(xì)胞還缺乏廣譜的公認(rèn)的標(biāo)志物，且絕大多數(shù)分離工作均局限于肝癌細(xì)胞系，直接從人癌組織分離并培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞尚無(wú)報(bào)道，嚴(yán)重阻礙了對(duì)肝癌干細(xì)胞的深入研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用直接無(wú)血清培養(yǎng)的方法，從肝癌細(xì)胞株以及人原代肝癌組織中分離出肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞并連續(xù)傳代并嘗試建立一種可有效富集肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的體外無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)，以期建立一種從人肝癌組織中分離培養(yǎng)獲得腫瘤

3、干細(xì)胞樣細(xì)胞的新方法。并對(duì)培養(yǎng)出的球狀細(xì)胞進(jìn)行體外侵襲性，細(xì)胞周期的變化，細(xì)胞耐藥性，克隆細(xì)胞的體外分化能力以及成瘤能力等方面驗(yàn)證我們獲得的細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性；進(jìn)一步進(jìn)行RNA深度測(cè)序和生物信息學(xué)分析，檢測(cè)肝癌干細(xì)胞與肝癌細(xì)胞之間的差異。
　　 1、人肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的新型培養(yǎng)基的篩選及腫瘤細(xì)胞系的建立
　　 為更好的培養(yǎng)擴(kuò)增肝癌干細(xì)胞，我們對(duì)培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)探索，篩選出7種有效的培養(yǎng)體系。培養(yǎng)

4、成分包括DMEM-F12，非必需氨基酸，血清替代物，N2，B27，B27-minusVA，BSA，EGF，bFGF以及我們自己篩選的2個(gè)細(xì)胞因子IGF-1和FGF-10。通過(guò)長(zhǎng)期的篩選實(shí)驗(yàn)證實(shí)C3號(hào)培養(yǎng)配方是我們的最佳培養(yǎng)體系。這個(gè)配方包含了B27-minusVA，EGF和我們篩選的IGF-1和FGF-10。
　　 利用無(wú)血清C3培養(yǎng)基對(duì)肝癌細(xì)胞系、原代細(xì)胞系及異種移植技術(shù)得到的腫瘤組織等多種來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并獲得了球狀細(xì)胞

5、。從肝癌細(xì)胞系Hep3B和Huh7中培養(yǎng)出來(lái)的球狀細(xì)胞Hep3B-C、Huh7-C克隆形態(tài)越來(lái)越明顯，并且能夠穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。從高侵襲性的細(xì)胞株HCCLM3和MHCC97-H及低侵襲能力的細(xì)胞株MHCC97-L分別培養(yǎng)得到了HCCLM3-C、MHCC97-H-C和MHCC97-L-C。在肝癌細(xì)胞系中成功得到球狀生長(zhǎng)的細(xì)胞之后，我們?nèi)〔∪说哪[瘤組織直接進(jìn)行消化培養(yǎng)，同樣獲得了球狀細(xì)胞EHBH-HCSC-1和EHBF-HCSC-2細(xì)胞。同時(shí)，

6、采用了異種移植技術(shù)，將病人的腫瘤組織直接包埋于小鼠皮下，一段時(shí)間后取小鼠的皮下腫瘤組織消化培養(yǎng)，分別利用常規(guī)的DMEM-F12+10％FBS和C3無(wú)血清培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，得到了一株呈上皮狀生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞系EHBH-3和球狀細(xì)胞EHBH-HCSC-3。
　　 2、球狀細(xì)胞生物學(xué)特性分析
　　 經(jīng)C3無(wú)血清培養(yǎng)體系獲得了球狀細(xì)胞后，進(jìn)一步對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了生物學(xué)特性的分析：
　　 1)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt-

7、1，CD90,Ep-CAM，NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3在Hep3B、Huh7、MHCC97-L、HCCLM3、Hep3B-C、Huh7-C、MHCC97-L-C、HCCLM3-C中的表達(dá)情況。結(jié)果表明CD90在球狀細(xì)胞中表達(dá)量都高于其相對(duì)應(yīng)的貼壁肝癌細(xì)胞株。其中，Huh7-C中CD90的表達(dá)量是Huh7中表達(dá)量的10倍。球狀細(xì)胞與相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞株相比NOTCH的mRNA表達(dá)均下降，而在Wnt-1和Ep-CAM的mRNA表達(dá)水

8、平上出現(xiàn)了不一致的現(xiàn)象。
　　 2)對(duì)球狀細(xì)胞進(jìn)行糖原染色以及ICG的攝取實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了這些細(xì)胞確實(shí)是肝癌細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞，而不是其他細(xì)胞污染。
　　 3)利用體外Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)直接比較Huh7細(xì)胞與Huh7-C細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)球狀細(xì)胞Huh7-C與對(duì)應(yīng)的Huh7細(xì)胞都具有較強(qiáng)的侵襲特性。定量分析結(jié)果表明，球狀細(xì)胞Huh7-C的侵襲程度比Huh7高接近3倍。
　　 4)通過(guò)細(xì)胞周期的分析發(fā)現(xiàn)球狀細(xì)胞

9、Hep3B-C和Huh7-C主要處于G0-G1期，所占的百分比分別為74.09％和.59.20％，與肝癌細(xì)胞株Hep3B和Huh7具有顯著差異。
　　 5)流式細(xì)胞儀和RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在球狀細(xì)胞中CD90的表達(dá)量均有不同程度的提高，兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致。在Hep3B-C細(xì)胞中，其提高倍數(shù)達(dá)10倍以上，這與之前的研究者所獲得的肝癌干細(xì)胞的表型一致。同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞的表面抗原Ep-CAM的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種球狀細(xì)胞的表達(dá)量都是

10、下降的，這與以前的研究是相悖的。
　　 6)在Hep3B-C和Huh7-C細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與相對(duì)應(yīng)的Hep3B和Huh7相比較，在相同時(shí)間里面，球狀細(xì)胞攝入的阿霉素的量少于普通的貼壁肝癌細(xì)胞，這是細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要的條件。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞在不同的藥物濃度下的存活率實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，球狀細(xì)胞Huh7-C相對(duì)于貼壁的肝癌細(xì)胞Huh7具有良好的耐藥性。球狀細(xì)胞對(duì)臨床證實(shí)的第一個(gè)針對(duì)肝癌靶向性的藥物索拉非尼的耐藥性實(shí)驗(yàn)中

11、也證實(shí)了這一點(diǎn)：應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的球狀細(xì)胞在40umol/L的sorafinib的濃度下48小時(shí)依然有46％的細(xì)胞存活，而與此相對(duì)照的貼壁肝癌細(xì)胞Huh7基本沒(méi)有細(xì)胞存活。耐藥性實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)無(wú)血清條件培養(yǎng)獲得的球狀細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比具有良好的耐藥性。
　　 7)ELISA定量檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明無(wú)論是貼壁的肝癌干細(xì)胞還是球狀的肝癌細(xì)胞均可以大量表達(dá)VEGF，而不同的細(xì)胞所形成的球狀的細(xì)胞中其表達(dá)趨勢(shì)并不是一致的，這可能與很多因

12、素有關(guān)。
　　 8)對(duì)獲得的球狀細(xì)胞的進(jìn)一步進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化。分別選取肝癌細(xì)胞的標(biāo)記CK8、CK18；膽管細(xì)胞的標(biāo)記CK19；血管細(xì)胞的標(biāo)記Tie2。Huh7表達(dá)CK8和CK18，但不表達(dá)CK19和Tie2，而Huh7-C細(xì)胞對(duì)這4個(gè)標(biāo)記表達(dá)很弱或不表達(dá)。將Huh7-C誘導(dǎo)后細(xì)胞均表達(dá)這4個(gè)標(biāo)記因子。這個(gè)結(jié)果提示我們可能球狀細(xì)胞具有多向分化的潛能，可以形成各種不同類(lèi)型的細(xì)胞，這需要我們找到誘導(dǎo)的最佳條件，從而真正能夠了解這些懸浮

13、、球狀生長(zhǎng)的細(xì)胞。
　　 9)本課題通過(guò)給NOD/SCID鼠背部皮下注射不同細(xì)胞數(shù)量的肝癌貼壁細(xì)胞與球狀生長(zhǎng)的細(xì)胞，比較球狀細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的成瘤能力。異種移植成瘤試驗(yàn)的結(jié)果顯示：接種100個(gè)MHCC97-L-C細(xì)胞到NOD/SCID小鼠中可以100％形成腫瘤；1000個(gè)HCCLM3-C細(xì)胞接種成瘤率高達(dá)100％；而對(duì)應(yīng)的貼壁細(xì)胞成瘤率卻很低。在MHCC97-H-C細(xì)胞株成瘤實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)100個(gè)細(xì)胞就可以在NOD/SCID鼠皮下成瘤

14、，10000個(gè)MHCC97-H-C細(xì)胞在小鼠中成瘤率可達(dá)到100％，而相同數(shù)量的貼壁細(xì)胞MHCC97-H卻不能形成腫瘤。小鼠皮下注射105個(gè)Huh7細(xì)胞都不能形成腫瘤，但是105個(gè)球狀細(xì)胞Huh7-C能100％形成腫瘤。
　　 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)經(jīng)C3無(wú)血清培養(yǎng)體系獲得的球狀細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性，可以作為肝癌干細(xì)胞研究的對(duì)象。
　　 3、肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的深度測(cè)序以及生物信息學(xué)分析
　　 采用Illumin

15、aHiSeqTM2000測(cè)序技術(shù)分別對(duì)3株肝癌干細(xì)胞株樣品Huh7-C，Hep3B-C，MHCC97-H-C以及對(duì)應(yīng)的3株肝癌細(xì)胞株樣品Huh7，Hep3B，MHCC97-H進(jìn)行RNA深度測(cè)序，采用RPKM算法對(duì)原始RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，消除系統(tǒng)誤差；采用倍數(shù)法(FoldChange)篩選差異表達(dá)基因，通過(guò)文本挖掘進(jìn)一步篩選到44個(gè)肝癌干細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵基因，采用Onto-Express軟件將篩選到的基因映射到GeneOntology

16、數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行功能富集性分析。并進(jìn)一步在通路水平上進(jìn)行的富集性分析，將篩選后得到的基因分別映射到GeneGO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果僅篩選到了1條關(guān)鍵通路，滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)指標(biāo)p-value<0.05，基于GeneGO數(shù)據(jù)的分析中則篩選到了17肝癌干細(xì)胞相關(guān)的通路(p-value<0.05)，其中補(bǔ)體通路被2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)篩選到，可能在肝癌干細(xì)胞的分子過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。
　　 另外，本文分別對(duì)2株肝

17、癌細(xì)胞系Hep3B，Huh7和2株肝癌干細(xì)胞系Hep3B-C，Huh7-C進(jìn)行了sRNA深度測(cè)序，采用SOAP軟件將sRNA定位到基因組上，分析sRNA在基因組上的表達(dá)和分布情況；將4個(gè)樣品中的小RNA片段和已知的miRNA、重復(fù)序列、Genbank、Rfam、外顯子和內(nèi)含子、piRNA信息進(jìn)行比對(duì)和注釋?zhuān)徊捎帽稊?shù)法篩選在肝癌干細(xì)胞系與肝癌細(xì)胞系中表達(dá)發(fā)生變化的sRNA，利用泊松分布計(jì)算p-value值，并用Benjamini多重假設(shè)檢

18、驗(yàn)校正p-value值；共篩選到4個(gè)repeat片段在Hep3B和Hep3B-C、Huh7和Huh7-C中均差異表達(dá)，37個(gè)高表達(dá)、9個(gè)低表達(dá)的piRNA以及18個(gè)在Hep3B-C/Hep3B，Huh7-C/Huh7中表達(dá)同增同減的miRNA，其中高表達(dá)的miRNA有9個(gè)，低表達(dá)的有9個(gè)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p-value<0.01，q-value<0.01)。
　　 通過(guò)生物信息學(xué)分析我們得到了很多差異表達(dá)的基因，接下來(lái)的任務(wù)任重