以PDF為靶點的新藥篩選及活性組分的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定與活性研究.pdf

1、隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，各種耐藥病原菌大量出現(xiàn)，目前臨床耐藥菌的發(fā)展勢態(tài)已對人類健康構(gòu)成極大的威脅。尋找新的作用靶點，研發(fā)新型抗耐藥菌的藥物已成為本世紀全球關(guān)注的研究熱點之一。肽脫甲?；?peptide deformylase，PDF)是原核生物蛋白成熟過程中的一個關(guān)鍵酶，而非真核生物所必需。鑒于PDF具有作為藥物篩選靶點的眾多優(yōu)點，近年來被廣泛認同為最理想的新一代廣譜抗菌藥物篩選分子靶點之一。 本研究采用分子生物學的方

2、法與技術(shù)對屎腸球菌(E.faecium)的PDF酶進行克隆表達，用Ni2+金屬螯合親和層析柱對目的蛋白進行分離純化，對純化所得PDF進行Western blotting鑒定與活性檢測。 以純化的PDF為靶點開展了抑酶活性物質(zhì)篩選和以E.faecium為檢定菌的抑菌活性物質(zhì)篩選。通過對20261個微生物發(fā)酵樣品的初篩和對初篩陽性樣品的兩次復篩，獲得6株發(fā)酵產(chǎn)物活性穩(wěn)定的陽性菌株，其中游動放線菌103A-00723和游動放線菌I03

3、A-08772的發(fā)酵產(chǎn)物對多種G+耐藥細菌有抑菌活性，包括MRSA、MRSE、E.faecalis HH22(含雙功能修飾酶的糞腸球菌)和VRE。經(jīng)分類鑒定，這兩株菌為游動放線菌屬的兩個新種，分別被命名為Actinoplanes sichuanensis sp.nov．和Actinoplanes Xinjiangensis sp.nov．。鏈霉菌I06A-01113的發(fā)酵產(chǎn)物抗VRE和S．a(chǎn)ureus(金黃色葡萄球菌)的敏感株，但不抗M

4、RSA。 對獲得的陽性菌株I03A-00723進行放大發(fā)酵，并對發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化，得到95—1、95—1—h1、95—2、95—3、135、205—1、205—2和205—3八個單一組分，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析95—1、95—2、135、205—1分別被確定為Nb—乙酰色胺、大豆苷元、染料木素和腺苷，95—1—h1、95—3、205—2和205—3因量太少，其結(jié)構(gòu)有待進一步鑒定。本研究首次從游動放線菌中分離得到Nb—乙酰色胺、大豆苷元和

5、染料木素，并首次發(fā)現(xiàn)這三個活性物質(zhì)對PDF酶有抑制作用，而且對E.faecium有抗菌活性，且大豆苷元和染料木素對VRE的抗菌活性優(yōu)于陽性對照Actinonin。含量極少的組分95—3對VRE的抗菌活性優(yōu)于Actinonin和已報道的陽性化合物BB3497和VRC3375，與已進入臨床研究的陽性化合物LBM415的抗菌活性相當，是值得深入研究的組分。 本研究還以PDF的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，采用syby17.3軟件中的Surflex—

6、Dock對我室Microbial Natural Products Database(微生物天然產(chǎn)物庫)進行了虛擬篩選，對部分虛擬篩選陽性化合物進行了抑酶和抗菌活性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虛擬篩選獲得的陽性化合物Polyoxin B、Spergualin和L-4-oxalysine具有一定的抑酶和抗菌活性。同時，對實物篩選獲得的陽性化合物和已知陽性抑制劑(Actinonin、LBM415、BB83698、VRC4307、VRC3375和BB34