人腦膠質瘤侵襲性的磁共振波譜評價和分子機制研究.pdf

1、第一部分：磁共振波譜成像對人腦膠質瘤侵襲性的應用研究
　　目的：腦膠質瘤是腦內最常見的原發(fā)性腫瘤，絕大多數(shù)膠質瘤為侵襲性生長，表現(xiàn)為惡性特征。關于膠質瘤的侵襲性的影像學評價一直是關注的重點。磁共振波譜成像作為非侵入性檢查技術，可以獲得活體腦組織的生理及病理的代謝產物信息。通過這些代謝產物的變化可以對膠質瘤疾病進行定性診斷及判定隨后的治療效果，磁共振波譜成像中1H-MRS因為其應用的廣度和成熟度，逐漸成為對膠質瘤進行評價的重要手段。

2、1H-MRS結合傳統(tǒng)MRI技術可以提高腦膠質瘤術前診斷和病理分級的準確性，反映腦膠質瘤的生化物質代謝特性，從而使臨床選擇最合理的治療方案。本研究主要的研究目的是通過對各病理級別腦膠質瘤病灶及瘤周組織1H-MRS特點進行分析，探討1H-MRS對于腦膠質瘤侵襲性的評價作用。
　　方法：在臨床選行手術治療并病理證實的膠質瘤患者54例，其中男性32例，女性22例。年齡范圍為20-77歲，平均年齡為46歲。選取志愿者30名作為對照組，年齡為

3、18-64歲，平均年齡為43歲。兩名副主任及以上級別的病理科醫(yī)生采用雙盲法對患者的病理切片進行診斷，根據(jù)W HO2016年標準的對膠質瘤的分級進行組別劃分，低級別組（包括WHOⅠ、Ⅱ級），高級別組（包括WHOⅢ、Ⅳ級），其中低級別組24例，高級別組30例。另外兩名副主任及以上級別的影像科醫(yī)生采用雙盲法對患者的常規(guī)顱腦MR及增強MR圖像進行分析，依據(jù)以下標準進行分組：非水腫組，（常規(guī)MR檢查及增強MR檢查病變范圍無明顯變化），此組共18例

4、；水腫組（增強MR檢查病變范圍明顯小于常規(guī)MR檢查），此組共36例。對上述各組患者及志愿者進行顱腦常規(guī)MRI、增強MRI掃描及增強掃描48小時后的1H-MRS掃描。進行1H-MRS掃描時膠質瘤患者利用T2WI圖像進行感興趣區(qū)(ROI)的選取，ROI位于病灶在軸位T2 WI圖像上顯示的最大層面，應該盡量包括膠質瘤瘤體、瘤體周圍水腫帶、瘤體周圍無水腫區(qū)。應該盡量避開空氣、骨骼及脂肪組織。瘤體周圍RO I范圍為瘤體周圍2-15mm。志愿者RO

5、I區(qū)選擇在側腦室上方半卵圓中心第一部分磁共振波譜成像對人腦膠質瘤侵襲性的應用研究
　　結果：高低級別組瘤體區(qū)代謝產物比值與對照組正常腦組織代謝產物比值具有差異，差異具有統(tǒng)計學意義,具體差異為Cho/Cr、Cho/NAA明顯升高，NAA/Cr降低;高級別組于低級別組瘤體代謝產物各比值比較，高級別組Cho/Cr、Cho/NAA值高于低級別組，NAA/Cr值低于低級別組，差異具有統(tǒng)計學意義。高低級別組瘤周組織代謝產物比值與對照組正常腦組

6、織代謝產物比值有差異，差異具有統(tǒng)計學意義,具體差異為Cho/Cr、Cho/NAA明顯升高，NAA/Cr降低；高級別組于低級別組瘤周組織代謝產物各比值比較，高級別組Cho/Cr、Cho/NAA值高于低級別組，差異具有統(tǒng)計學意義，NAA/Cr值低于低級別組，差異無統(tǒng)計學意義。水腫組瘤體區(qū)與對照組正常腦組織代謝產物比值比較具有差異，差異具有統(tǒng)計學意義,具體差異為，Cho/Cr、Cho/NAA明顯升高，NAA/Cr降低;非水腫組瘤體區(qū)與對照組正

7、常腦組織代謝產物比值比較，Cho/NAA升高，NAA/Cr降低，Cho/Cr比值升高，差異有統(tǒng)計學意義，水腫組與非水腫組瘤體區(qū)代謝產物比值比較，Cho/NAA,NAA/Cr，Cho/Cr差異無統(tǒng)計學意義。水腫組瘤周組織與對照組正常腦組織代謝產物比值有差異，差異具有統(tǒng)計學意義,具體差異為Cho/Cr、Cho/NAA升高，NAA/Cr降低；非水腫組瘤周區(qū)與對照組正常腦組織代謝產物比值比較，Cho/NAA升高，NAA/Cr降低，差異具有統(tǒng)計學

8、意義，Cho/Cr差異無統(tǒng)計學意義。水腫組與非水腫組組瘤周組織代謝產物各比值比較，Cho/NAA升高，差異具有統(tǒng)計學意義,NAA/Cr和 Cho/Cr差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論：1H-MRS可以對膠質瘤的代謝特點進行分析，對不同級別的膠質瘤對周圍組織的侵襲性作出評價。1H-MRS對顱腦常規(guī)MRI判斷膠質瘤周圍水腫區(qū)的侵襲性作出補充證明并且能對對不出現(xiàn)瘤周水腫的膠質瘤的瘤周組織的侵襲性提供新的評價手段。
　　第二部分：β-c

9、atenin與Fra-1相關蛋白在人腦膠質瘤的表達及其與1H-MRS波譜的相關性研究
　　目的：在分子水平上，膠質瘤的侵襲性受到多種細胞因子的調控，這其中Wnt/β-catenin信號通路及原癌基因Fra-1在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中起到關鍵的作用。然而目前為止對于Wnt/β-catenin信號通路中重要因子的β-catenin及Fra-1在膠質瘤中的表達及作用機制研究較少，對于其與評價膠質瘤侵襲性重要手段的1H-MRS波譜的關系研究更少

10、。本研究旨在通過人腦膠質瘤中β-catenin及Fra-1相關蛋白這兩種與侵襲性相關的因子的表達進行測定，判斷β-catenin及Fra-1相關蛋白在不同級別人腦膠質瘤中的表達水平是否存在差異，從而確定其對膠質瘤侵襲性的促進作用；并對膠質瘤中β-catenin及Fra-1相關蛋白的免疫組化結果與1H-MRS代謝產物水平進行相關性研究，以期望在分子水平找到1H-MRS評價膠質瘤侵襲能力的理論依據(jù)。
　　方法：選取2014-2015年

11、于河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院行手術治療并病理證實的膠質瘤患者87例，其中男性51例，女性36例。年齡范圍為20-77歲，平均年齡為46歲?；颊咴谥橥馇闆r下進行檢查。另外選取顱腦外傷內減壓需切除腦實質組織患者15例，作為免疫組化的對照組。兩名副主任及以上級別的病理科醫(yī)生采用雙盲法對患者的病理切片進行診斷，根據(jù)WHO2016年標準對膠質瘤的分級進行組別劃分，低級別組（包括WHOⅠ、Ⅱ級），高級別組（包括WHOⅢ、Ⅳ級），其中低級別組43例，高

12、級別組44例.對膠質瘤患者行常規(guī)MR及顱腦1H-MRS掃描，將圖像導入西門子syngo MR圖像工作站進行處理，ROI選取瘤體區(qū)（盡量選取瘤體實質，避開壞液化壞死區(qū)域），計算Cho/Cr、NAA/Cr、和Cho/NAA比值。上述患者膠質瘤瘤體區(qū)及顱腦外傷減壓患者的正常腦組織進行免疫組化分析，取材時應以膠質瘤患者術前常規(guī)MRI及1H-MRS圖像結果，與臨床手術醫(yī)師進行討論取材位置。免疫組化主要針對膠質瘤及正常腦組織內β-catenin及F

13、ra-1的表達情況進行分析。免疫組化結果采取兩名病理科醫(yī)生雙盲法計算膠質瘤β-catenin及Fra-1的增殖指數(shù)并參照 Fromowitz標準進行評分：免疫組化結果評分=染色強度評分×陽性細胞百分率評分，評分在0-6分定義低表達，7-12分定義為高表達。應用統(tǒng)計學軟件對對正常組、低級別組及高級別組膠質瘤中β-catenin及Fra-1的表達情況進行分析，對β-catenin及Fra-1在膠質瘤中的增殖指數(shù)PI對及1H-MRS各代謝產物

14、比值進行相關性分析。
　　結果：β-catenin在正常腦組織內僅在細胞膜內存有少許的表達，表現(xiàn)為棕黃色染色，在低級別膠質瘤內主要表達在胞漿內，高級別膠質瘤內表達于細胞核內。低級別膠質瘤43例，β-catenin的低表達為30例，高表達為13例，高表達率為30.2％。高級別膠質瘤44例，β-catenin的低表達為19例，高表達為25例，高表達率為56.8%。高低級別組膠質瘤內β-cateni n的表達差異存在統(tǒng)計學意義。Fra-

15、1在低級別膠質瘤內低表達為34例，高表達為9例，高表達率為20.0%，F(xiàn)ra-1在高級別膠質瘤內低表達為18例，高表達為26例，高表達率為59.1%，F(xiàn)ra-1在高低級別膠質瘤內表達的差異存在統(tǒng)計學意義。β-catenin與Fra-1在膠質瘤內的差異表達與性別、年齡、腫瘤的大小、腫瘤發(fā)生的位置無關。β-catenin與Fra-1的在膠質瘤內的表達成正相關。1H-MRS各代謝物與β-catenin、Fra-1在膠質瘤細胞內的增殖指數(shù)PI進

16、行Pearson相關性檢驗發(fā)現(xiàn)，Cho/Cr同β-catenin PI呈正相關，NAA/Cr與β-catenin PI呈負相關；Cho/NAA與β-catenin PI呈正相關。與上述結果相仿,Cho/Cr同F(xiàn)ra-1 PI呈正相關；NAA/Cr與Fra-1 PI呈負相關；Cho/NAA與 Fra-1 PI呈正相關。
　　結論：本研究通過對膠質瘤患者標本進行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)膠質瘤侵襲性相關的β-catenin及Fra-1蛋白在不

17、同級別膠質瘤級別中的差異性表達，證實了β-catenin及Fra-1蛋白這兩種因子參與了膠質瘤的發(fā)生及侵襲能力的增加。又通過對1H-MRS結果與β-catenin及Fra-1表達相關性研究發(fā)現(xiàn)，Cho/NAA及Cho/Cr與β-catenin級Fra-1蛋白在膠質瘤內的表達成明顯的正相關，NAA/Cr與其表達成明顯的負相關，從細胞增殖，細胞的代謝兩個方面證實了β-catenin、Fra-1蛋白的表達及1H-MRS可以從不同的角度評價腫瘤

18、的侵襲性，并相互聯(lián)系。
　　第三部分：Wnt3a/β-catenin與Fra-1調控膠質瘤侵襲性的分子機制研究
　　目的:通過上面關于人膠質瘤侵襲性的研究已經(jīng)表明β-catenin、Fra-1在不同級別膠質瘤中的表達具有差異性，并對膠質瘤的的侵襲性具有評價作用。以前的研究表明上皮間質化是惡性腫瘤發(fā)生轉移及侵襲的重要過程，而Fra-1是上皮間化（EMT）中的主要因子。然而，F(xiàn)ra-1在神經(jīng)膠質瘤的調節(jié)機制尚不清楚。Wnt/β-

19、catenin號轉導通路影響細胞的存活、增殖能力、轉移能力和細胞極性。Wnt/β-catenin信號傳導通路的作用已被很多研究證實，但由于Wnt/β-catenin信號轉導在神經(jīng)膠質瘤中膠質瘤侵襲能力的重要影響，因此鑒別該信號傳導通路的靶向基因有助于更好地了解該信號傳導通路的作用機制。本研究旨在通過一系列的分子生物學實驗研究Fra1與Wnt/β-catenin對膠質瘤侵襲性能力影響的作用機制，證明Wnt/β-catenin與Fra-l作

20、為信號傳導軸在神經(jīng)膠質瘤侵襲能力發(fā)展中的關鍵作用，為惡性膠質瘤提供新的治療靶點。
　　方法:
　　1.在不同濃度Wnt3a條件下處理U-251和U-87細胞后，對其上皮標志物E-cadherin和ZO-1以及間質標志物 Vimentin和 Fibronectin進行QT-PCR及蛋白印記法檢測其mRNA及蛋白水平的表達差異。
　　2.采用免疫熒光、QT-PCR及蛋白印記法研究外源性Wnt3a存在與否及沉默β-caten

21、in與否狀態(tài)下，膠質瘤細胞中Vimentin的mRNA及蛋白水平的表達差異。
　　3.研究外源性Wnt3a存在與否的情況下，對EMT相關主要因子進行QT-PCR及蛋白印記法檢測其在膠質瘤細胞中的表達差異。
　　4.通過將膠質瘤細胞暴露在 GSK-3β特異性抑制劑(LiCl和CHIR99021)前，對其進行QT-PCR及蛋白印記法檢測Fra1的mRNA和蛋白水平。
　　5.首先通過熒光素酶實驗驗證在不同濃度的Wnt3a條

22、件處理下，F(xiàn)ra1啟動子（-2500/+1）轉錄活性的差異，再通過構建不同長度的及存在Tcf/Lef結合位點突變基因的Fra1的啟動子，在外源性Wnt3a存在與否的條件性進行熒光素酶反應檢查不同啟動子的轉錄活性差異。
　　6.對膠質瘤細胞進行外源性Wnt3a存在與否的處理，選擇加入β-catenin和IgG抗體進行染色質免疫共沉淀，在通過QT-PCR技術研究Fra1啟動子在不同條件下的表達差異。
　　7.通過對過表達Fra1

23、質粒及Fra1-siRNA轉染的膠質瘤細胞進行蛋白質印跡實驗，研究EMT相關主要因子在蛋白水平的表達差異。
　　8.對Fra1-siRNA及β-catenin-siRNA進行轉染的膠質瘤加入或者不加入外源性Wnt3a細胞進行培養(yǎng)，再通過對其進行細胞傷口愈合實驗及細胞侵襲實驗，研究不同狀態(tài)下膠質瘤細胞的侵襲能力的差異。
　　9.通過對沉默F(xiàn)ra1（Fra1-siRNA對膠質瘤細胞進行轉染）的膠質瘤細胞Wnt3a存在與否狀態(tài)進行

24、QT-PCR及蛋白質印跡實驗，研究EMT相關主要因子的的表達差異。
　　10.CCK法檢測在外源性Wet3a存在與否及沉默或過表達Fra1轉染的膠質細胞暴露于順鉑的情況下的細胞生存狀態(tài)的差異。
　　11.通過流式細胞術檢查穩(wěn)定轉染W(wǎng)nt3a過表達及沉默F(xiàn)ra-1的膠質瘤細胞，經(jīng)過順鉑處理后細胞凋亡水平的差異。
　　12.穩(wěn)定轉染W(wǎng)nt3a過表達及沉默F(xiàn)ra-1的膠質瘤細胞注入小鼠體內產生膠質瘤后，通過實驗研究膠質瘤瘤體

25、對不同濃度的順鉑的抵抗程度的差異。
　　結果：
　　1.在神經(jīng)膠質瘤細胞中，激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉導會誘導EMT。在U-251和U-87細胞中，隨著Wnt3a劑量濃度的升高，Vimentin和Fibronectin在mRNA水平和蛋白水平表達都升高，E-cadherin和ZO-1的表達下降，免疫熒光結果顯示在神經(jīng)膠質瘤細胞中， Wnt3a激活Wnt/β-catenin信號轉導，促進Vimentin的表達，而通過使沉默

26、β-catenin沉默來封閉β-catenin信號轉導通路，會抑制Vimentin的表達。這些結果表明Wnt/β-catenin信號轉導通路在神經(jīng)膠質瘤EMT中起促進作用。在激活Wnt/β-catenin信號轉導后，通過Wnt3a處理后，EMT相關所有的因子都有不同程度的升高，但Fra1的mRNA和蛋白質水平都顯著上調。
　　2.使用GSK-3β特異性抑制(LiCl和CHIR99021對膠質瘤細胞進行處理后，F(xiàn)ra1的mRNA和蛋

27、白水平增加（圖2A和2B）。同時，熒光素酶基因報告實驗表明暴露Wnt3a會以劑量依賴方式增加Fra1啟動子的轉錄活性（-2500/+1），并進一步證實證實Fra1在蛋白水平上的增加。通過不同長度及含有Tcf/Lef突變結合位點的啟動子進行的熒光素酶基因報告實驗表明當-1500和-500區(qū)域缺失時，F(xiàn)ra1喪失對Wnt3a處理的應答能力。DNA片段(-1500/-500)含有兩種假定的Tcf/Lef結合位點。后位突變能夠顯著降低Wnt3a

28、誘導的報道分子的活性。ChIP試驗進一步證明在轉錄開始位點的上游，β-catenin/Tcf/Lef轉錄復合物能直接與Fra1啟動子結合，并在Wnt3a刺激下，該結合增強。這些結果表明Wnt/β-catenin號轉導通過反式激活上調Fra1的表達。
　　3.Fra1過表達會下調上皮標記物的表達并上調間質標記物的表達，而沉默F(xiàn)ra1后情況相反。無論沉默F(xiàn)ra1或β-catenin都會減弱U-251細胞的遷移和入侵能力。在膠質瘤U-8

29、7細胞中，敲除β-catenin減弱Wnt3a膠質瘤侵襲性的促進作用。Wnt3a誘導的U-251cells的遷移和侵襲性在沉默F(xiàn)ra1后而被完全消除。沉默F(xiàn)ra1表達后后，Wnt3a誘導的EMT-TFs上調作用明顯減弱。以上的研究結果表明在神經(jīng)膠質瘤細胞中，Wnt3a誘導的Fra1上調在EMT中必不可少，而EMT是由Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉導所誘導。
　　4.膠質瘤細胞在Wnt3a作用下順鉑抵抗值是對照組的1.67倍。過表達的F

30、ra1促進順鉑抵抗，IC50是對照組的1.44倍。然而，沉默F(xiàn)ra1會增強膠質瘤細胞對順鉑的敏感性，IC50降低到0.69倍。穩(wěn)定性沉默F(xiàn)ra1并且過表達Wnt3a的U-251細胞與對照組相比，在激活Wnt/β-catenin信號轉導通路會降低膠質瘤細胞對順鉑誘導的細胞凋亡但在沉默F(xiàn)ra1后，這種抵抗作用沒有顯示，在上述方法處理的U87的膠質瘤細胞中也得到了相同的結果。裸鼠移植瘤實驗研究發(fā)現(xiàn)表明Wnt3a過表達會增強膠質瘤對順鉑的抵抗，

31、并沉默F(xiàn)ra1會增強神經(jīng)膠質瘤細胞對順鉑的敏感性。重要的是，F(xiàn)ra1沉默會抑制Wnt3a對順鉑的抵抗作用。總之，Wnt/β-連環(huán)蛋白/Fra1軸在神經(jīng)膠質瘤細胞的順鉑抵抗中發(fā)揮關鍵作用。
　　結論：本研究通過對膠質瘤細胞進行不同濃度Wen3a、沉默β-catenin及Fra-1的處理，然后檢測EMT相關的mRNA及蛋白的表達水平，從而證實Wnt/β-catenin信號轉導通路能通過上調Fra-1的表達誘導神經(jīng)膠質瘤細胞發(fā)生EMT。

32、又通過構建不同長度及Tcf/Lef突變型基因的Fra-1啟動子用于熒光酶素反應實驗及免疫共沉淀實驗進一步研究表明Wnt/β-catenin信號轉導通路通過直接結合來激活Fra-1轉錄，而且發(fā)現(xiàn)β-catenin-Tcf/Lef與WRE的轉錄復合物位于Fral啟動子的近側區(qū)。通過體內細胞生存及侵襲實驗，裸鼠瘤體抑制實驗證實不同表型下，順鉑的抵抗能力，表明Fra1在介導神經(jīng)膠質瘤入侵時發(fā)揮關鍵性作用，而神經(jīng)膠質瘤入侵是由Wnt/β-cate