人腦膠質(zhì)瘤侵襲性的磁共振波譜評(píng)價(jià)和分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：磁共振波譜成像對(duì)人腦膠質(zhì)瘤侵襲性的應(yīng)用研究
　　目的：腦膠質(zhì)瘤是腦內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，絕大多數(shù)膠質(zhì)瘤為侵襲性生長(zhǎng)，表現(xiàn)為惡性特征。關(guān)于膠質(zhì)瘤的侵襲性的影像學(xué)評(píng)價(jià)一直是關(guān)注的重點(diǎn)。磁共振波譜成像作為非侵入性檢查技術(shù)，可以獲得活體腦組織的生理及病理的代謝產(chǎn)物信息。通過(guò)這些代謝產(chǎn)物的變化可以對(duì)膠質(zhì)瘤疾病進(jìn)行定性診斷及判定隨后的治療效果，磁共振波譜成像中1H-MRS因?yàn)槠鋺?yīng)用的廣度和成熟度，逐漸成為對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行評(píng)價(jià)的重要手段。

2、1H-MRS結(jié)合傳統(tǒng)MRI技術(shù)可以提高腦膠質(zhì)瘤術(shù)前診斷和病理分級(jí)的準(zhǔn)確性，反映腦膠質(zhì)瘤的生化物質(zhì)代謝特性，從而使臨床選擇最合理的治療方案。本研究主要的研究目的是通過(guò)對(duì)各病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤病灶及瘤周組織1H-MRS特點(diǎn)進(jìn)行分析，探討1H-MRS對(duì)于腦膠質(zhì)瘤侵襲性的評(píng)價(jià)作用。
　　方法：在臨床選行手術(shù)治療并病理證實(shí)的膠質(zhì)瘤患者54例，其中男性32例，女性22例。年齡范圍為20-77歲，平均年齡為46歲。選取志愿者30名作為對(duì)照組，年齡為

3、18-64歲，平均年齡為43歲。兩名副主任及以上級(jí)別的病理科醫(yī)生采用雙盲法對(duì)患者的病理切片進(jìn)行診斷，根據(jù)W HO2016年標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)膠質(zhì)瘤的分級(jí)進(jìn)行組別劃分，低級(jí)別組（包括WHOⅠ、Ⅱ級(jí)），高級(jí)別組（包括WHOⅢ、Ⅳ級(jí)），其中低級(jí)別組24例，高級(jí)別組30例。另外兩名副主任及以上級(jí)別的影像科醫(yī)生采用雙盲法對(duì)患者的常規(guī)顱腦MR及增強(qiáng)MR圖像進(jìn)行分析，依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組：非水腫組，（常規(guī)MR檢查及增強(qiáng)MR檢查病變范圍無(wú)明顯變化），此組共18例

4、；水腫組（增強(qiáng)MR檢查病變范圍明顯小于常規(guī)MR檢查），此組共36例。對(duì)上述各組患者及志愿者進(jìn)行顱腦常規(guī)MRI、增強(qiáng)MRI掃描及增強(qiáng)掃描48小時(shí)后的1H-MRS掃描。進(jìn)行1H-MRS掃描時(shí)膠質(zhì)瘤患者利用T2WI圖像進(jìn)行感興趣區(qū)(ROI)的選取，ROI位于病灶在軸位T2 WI圖像上顯示的最大層面，應(yīng)該盡量包括膠質(zhì)瘤瘤體、瘤體周?chē)[帶、瘤體周?chē)鸁o(wú)水腫區(qū)。應(yīng)該盡量避開(kāi)空氣、骨骼及脂肪組織。瘤體周?chē)鶵O I范圍為瘤體周?chē)?-15mm。志愿者RO

5、I區(qū)選擇在側(cè)腦室上方半卵圓中心第一部分磁共振波譜成像對(duì)人腦膠質(zhì)瘤侵襲性的應(yīng)用研究
　　結(jié)果：高低級(jí)別組瘤體區(qū)代謝產(chǎn)物比值與對(duì)照組正常腦組織代謝產(chǎn)物比值具有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具體差異為Cho/Cr、Cho/NAA明顯升高，NAA/Cr降低;高級(jí)別組于低級(jí)別組瘤體代謝產(chǎn)物各比值比較，高級(jí)別組Cho/Cr、Cho/NAA值高于低級(jí)別組，NAA/Cr值低于低級(jí)別組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高低級(jí)別組瘤周組織代謝產(chǎn)物比值與對(duì)照組正常腦組

6、織代謝產(chǎn)物比值有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具體差異為Cho/Cr、Cho/NAA明顯升高，NAA/Cr降低；高級(jí)別組于低級(jí)別組瘤周組織代謝產(chǎn)物各比值比較，高級(jí)別組Cho/Cr、Cho/NAA值高于低級(jí)別組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NAA/Cr值低于低級(jí)別組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。水腫組瘤體區(qū)與對(duì)照組正常腦組織代謝產(chǎn)物比值比較具有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具體差異為，Cho/Cr、Cho/NAA明顯升高，NAA/Cr降低;非水腫組瘤體區(qū)與對(duì)照組正

7、常腦組織代謝產(chǎn)物比值比較，Cho/NAA升高，NAA/Cr降低，Cho/Cr比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，水腫組與非水腫組瘤體區(qū)代謝產(chǎn)物比值比較，Cho/NAA,NAA/Cr，Cho/Cr差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。水腫組瘤周組織與對(duì)照組正常腦組織代謝產(chǎn)物比值有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具體差異為Cho/Cr、Cho/NAA升高，NAA/Cr降低；非水腫組瘤周區(qū)與對(duì)照組正常腦組織代謝產(chǎn)物比值比較，Cho/NAA升高，NAA/Cr降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義，Cho/Cr差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。水腫組與非水腫組組瘤周組織代謝產(chǎn)物各比值比較，Cho/NAA升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,NAA/Cr和 Cho/Cr差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：1H-MRS可以對(duì)膠質(zhì)瘤的代謝特點(diǎn)進(jìn)行分析，對(duì)不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤對(duì)周?chē)M織的侵襲性作出評(píng)價(jià)。1H-MRS對(duì)顱腦常規(guī)MRI判斷膠質(zhì)瘤周?chē)[區(qū)的侵襲性作出補(bǔ)充證明并且能對(duì)對(duì)不出現(xiàn)瘤周水腫的膠質(zhì)瘤的瘤周組織的侵襲性提供新的評(píng)價(jià)手段。
　　第二部分：β-c

9、atenin與Fra-1相關(guān)蛋白在人腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)及其與1H-MRS波譜的相關(guān)性研究
　　目的：在分子水平上，膠質(zhì)瘤的侵襲性受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控，這其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路及原癌基因Fra-1在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用。然而目前為止對(duì)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路中重要因子的β-catenin及Fra-1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及作用機(jī)制研究較少，對(duì)于其與評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤侵襲性重要手段的1H-MRS波譜的關(guān)系研究更少

10、。本研究旨在通過(guò)人腦膠質(zhì)瘤中β-catenin及Fra-1相關(guān)蛋白這兩種與侵襲性相關(guān)的因子的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，判斷β-catenin及Fra-1相關(guān)蛋白在不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平是否存在差異，從而確定其對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲性的促進(jìn)作用；并對(duì)膠質(zhì)瘤中β-catenin及Fra-1相關(guān)蛋白的免疫組化結(jié)果與1H-MRS代謝產(chǎn)物水平進(jìn)行相關(guān)性研究，以期望在分子水平找到1H-MRS評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤侵襲能力的理論依據(jù)。
　　方法：選取2014-2015年

11、于河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院行手術(shù)治療并病理證實(shí)的膠質(zhì)瘤患者87例，其中男性51例，女性36例。年齡范圍為20-77歲，平均年齡為46歲。患者在知情同意情況下進(jìn)行檢查。另外選取顱腦外傷內(nèi)減壓需切除腦實(shí)質(zhì)組織患者15例，作為免疫組化的對(duì)照組。兩名副主任及以上級(jí)別的病理科醫(yī)生采用雙盲法對(duì)患者的病理切片進(jìn)行診斷，根據(jù)WHO2016年標(biāo)準(zhǔn)對(duì)膠質(zhì)瘤的分級(jí)進(jìn)行組別劃分，低級(jí)別組（包括WHOⅠ、Ⅱ級(jí)），高級(jí)別組（包括WHOⅢ、Ⅳ級(jí)），其中低級(jí)別組43例，高

12、級(jí)別組44例.對(duì)膠質(zhì)瘤患者行常規(guī)MR及顱腦1H-MRS掃描，將圖像導(dǎo)入西門(mén)子syngo MR圖像工作站進(jìn)行處理，ROI選取瘤體區(qū)（盡量選取瘤體實(shí)質(zhì)，避開(kāi)壞液化壞死區(qū)域），計(jì)算Cho/Cr、NAA/Cr、和Cho/NAA比值。上述患者膠質(zhì)瘤瘤體區(qū)及顱腦外傷減壓患者的正常腦組織進(jìn)行免疫組化分析，取材時(shí)應(yīng)以膠質(zhì)瘤患者術(shù)前常規(guī)MRI及1H-MRS圖像結(jié)果，與臨床手術(shù)醫(yī)師進(jìn)行討論取材位置。免疫組化主要針對(duì)膠質(zhì)瘤及正常腦組織內(nèi)β-catenin及F

13、ra-1的表達(dá)情況進(jìn)行分析。免疫組化結(jié)果采取兩名病理科醫(yī)生雙盲法計(jì)算膠質(zhì)瘤β-catenin及Fra-1的增殖指數(shù)并參照 Fromowitz標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：免疫組化結(jié)果評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分，評(píng)分在0-6分定義低表達(dá)，7-12分定義為高表達(dá)。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)對(duì)正常組、低級(jí)別組及高級(jí)別組膠質(zhì)瘤中β-catenin及Fra-1的表達(dá)情況進(jìn)行分析，對(duì)β-catenin及Fra-1在膠質(zhì)瘤中的增殖指數(shù)PI對(duì)及1H-MRS各代謝產(chǎn)物

14、比值進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：β-catenin在正常腦組織內(nèi)僅在細(xì)胞膜內(nèi)存有少許的表達(dá)，表現(xiàn)為棕黃色染色，在低級(jí)別膠質(zhì)瘤內(nèi)主要表達(dá)在胞漿內(nèi)，高級(jí)別膠質(zhì)瘤內(nèi)表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。低級(jí)別膠質(zhì)瘤43例，β-catenin的低表達(dá)為30例，高表達(dá)為13例，高表達(dá)率為30.2％。高級(jí)別膠質(zhì)瘤44例，β-catenin的低表達(dá)為19例，高表達(dá)為25例，高表達(dá)率為56.8%。高低級(jí)別組膠質(zhì)瘤內(nèi)β-cateni n的表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fra-

15、1在低級(jí)別膠質(zhì)瘤內(nèi)低表達(dá)為34例，高表達(dá)為9例，高表達(dá)率為20.0%，F(xiàn)ra-1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤內(nèi)低表達(dá)為18例，高表達(dá)為26例，高表達(dá)率為59.1%，F(xiàn)ra-1在高低級(jí)別膠質(zhì)瘤內(nèi)表達(dá)的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。β-catenin與Fra-1在膠質(zhì)瘤內(nèi)的差異表達(dá)與性別、年齡、腫瘤的大小、腫瘤發(fā)生的位置無(wú)關(guān)。β-catenin與Fra-1的在膠質(zhì)瘤內(nèi)的表達(dá)成正相關(guān)。1H-MRS各代謝物與β-catenin、Fra-1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的增殖指數(shù)PI進(jìn)

16、行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cho/Cr同β-catenin PI呈正相關(guān)，NAA/Cr與β-catenin PI呈負(fù)相關(guān)；Cho/NAA與β-catenin PI呈正相關(guān)。與上述結(jié)果相仿,Cho/Cr同F(xiàn)ra-1 PI呈正相關(guān)；NAA/Cr與Fra-1 PI呈負(fù)相關(guān)；Cho/NAA與 Fra-1 PI呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：本研究通過(guò)對(duì)膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤侵襲性相關(guān)的β-catenin及Fra-1蛋白在不

17、同級(jí)別膠質(zhì)瘤級(jí)別中的差異性表達(dá)，證實(shí)了β-catenin及Fra-1蛋白這兩種因子參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生及侵襲能力的增加。又通過(guò)對(duì)1H-MRS結(jié)果與β-catenin及Fra-1表達(dá)相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，Cho/NAA及Cho/Cr與β-catenin級(jí)Fra-1蛋白在膠質(zhì)瘤內(nèi)的表達(dá)成明顯的正相關(guān)，NAA/Cr與其表達(dá)成明顯的負(fù)相關(guān)，從細(xì)胞增殖，細(xì)胞的代謝兩個(gè)方面證實(shí)了β-catenin、Fra-1蛋白的表達(dá)及1H-MRS可以從不同的角度評(píng)價(jià)腫瘤

18、的侵襲性，并相互聯(lián)系。
　　第三部分：Wnt3a/β-catenin與Fra-1調(diào)控膠質(zhì)瘤侵襲性的分子機(jī)制研究
　　目的:通過(guò)上面關(guān)于人膠質(zhì)瘤侵襲性的研究已經(jīng)表明β-catenin、Fra-1在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)具有差異性，并對(duì)膠質(zhì)瘤的的侵襲性具有評(píng)價(jià)作用。以前的研究表明上皮間質(zhì)化是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及侵襲的重要過(guò)程，而Fra-1是上皮間化（EMT）中的主要因子。然而，F(xiàn)ra-1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。Wnt/β-

19、catenin號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響細(xì)胞的存活、增殖能力、轉(zhuǎn)移能力和細(xì)胞極性。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用已被很多研究證實(shí)，但由于Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中膠質(zhì)瘤侵襲能力的重要影響，因此鑒別該信號(hào)傳導(dǎo)通路的靶向基因有助于更好地了解該信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用機(jī)制。本研究旨在通過(guò)一系列的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究Fra1與Wnt/β-catenin對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲性能力影響的作用機(jī)制，證明Wnt/β-catenin與Fra-l作

20、為信號(hào)傳導(dǎo)軸在神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲能力發(fā)展中的關(guān)鍵作用，為惡性膠質(zhì)瘤提供新的治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.在不同濃度Wnt3a條件下處理U-251和U-87細(xì)胞后，對(duì)其上皮標(biāo)志物E-cadherin和ZO-1以及間質(zhì)標(biāo)志物 Vimentin和 Fibronectin進(jìn)行QT-PCR及蛋白印記法檢測(cè)其mRNA及蛋白水平的表達(dá)差異。
　　2.采用免疫熒光、QT-PCR及蛋白印記法研究外源性Wnt3a存在與否及沉默β-caten

21、in與否狀態(tài)下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Vimentin的mRNA及蛋白水平的表達(dá)差異。
　　3.研究外源性Wnt3a存在與否的情況下，對(duì)EMT相關(guān)主要因子進(jìn)行QT-PCR及蛋白印記法檢測(cè)其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)差異。
　　4.通過(guò)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞暴露在 GSK-3β特異性抑制劑(LiCl和CHIR99021)前，對(duì)其進(jìn)行QT-PCR及蛋白印記法檢測(cè)Fra1的mRNA和蛋白水平。
　　5.首先通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在不同濃度的Wnt3a條

22、件處理下，F(xiàn)ra1啟動(dòng)子（-2500/+1）轉(zhuǎn)錄活性的差異，再通過(guò)構(gòu)建不同長(zhǎng)度的及存在Tcf/Lef結(jié)合位點(diǎn)突變基因的Fra1的啟動(dòng)子，在外源性Wnt3a存在與否的條件性進(jìn)行熒光素酶反應(yīng)檢查不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性差異。
　　6.對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行外源性Wnt3a存在與否的處理，選擇加入β-catenin和IgG抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀，在通過(guò)QT-PCR技術(shù)研究Fra1啟動(dòng)子在不同條件下的表達(dá)差異。
　　7.通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)Fra1

23、質(zhì)粒及Fra1-siRNA轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，研究EMT相關(guān)主要因子在蛋白水平的表達(dá)差異。
　　8.對(duì)Fra1-siRNA及β-catenin-siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)瘤加入或者不加入外源性Wnt3a細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，再通過(guò)對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，研究不同狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力的差異。
　　9.通過(guò)對(duì)沉默F(xiàn)ra1（Fra1-siRNA對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染）的膠質(zhì)瘤細(xì)胞Wnt3a存在與否狀態(tài)進(jìn)行

24、QT-PCR及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，研究EMT相關(guān)主要因子的的表達(dá)差異。
　　10.CCK法檢測(cè)在外源性Wet3a存在與否及沉默或過(guò)表達(dá)Fra1轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)細(xì)胞暴露于順鉑的情況下的細(xì)胞生存狀態(tài)的差異。
　　11.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢查穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a過(guò)表達(dá)及沉默F(xiàn)ra-1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)順鉑處理后細(xì)胞凋亡水平的差異。
　　12.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a過(guò)表達(dá)及沉默F(xiàn)ra-1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)產(chǎn)生膠質(zhì)瘤后，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究膠質(zhì)瘤瘤體

25、對(duì)不同濃度的順鉑的抵抗程度的差異。
　　結(jié)果：
　　1.在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)誘導(dǎo)EMT。在U-251和U-87細(xì)胞中，隨著Wnt3a劑量濃度的升高，Vimentin和Fibronectin在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)都升高，E-cadherin和ZO-1的表達(dá)下降，免疫熒光結(jié)果顯示在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中， Wnt3a激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)Vimentin的表達(dá)，而通過(guò)使沉默

26、β-catenin沉默來(lái)封閉β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，會(huì)抑制Vimentin的表達(dá)。這些結(jié)果表明Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤EMT中起促進(jìn)作用。在激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，通過(guò)Wnt3a處理后，EMT相關(guān)所有的因子都有不同程度的升高，但Fra1的mRNA和蛋白質(zhì)水平都顯著上調(diào)。
　　2.使用GSK-3β特異性抑制(LiCl和CHIR99021對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行處理后，F(xiàn)ra1的mRNA和蛋

27、白水平增加（圖2A和2B）。同時(shí)，熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明暴露Wnt3a會(huì)以劑量依賴(lài)方式增加Fra1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性（-2500/+1），并進(jìn)一步證實(shí)證實(shí)Fra1在蛋白水平上的增加。通過(guò)不同長(zhǎng)度及含有Tcf/Lef突變結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子進(jìn)行的熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)-1500和-500區(qū)域缺失時(shí)，F(xiàn)ra1喪失對(duì)Wnt3a處理的應(yīng)答能力。DNA片段(-1500/-500)含有兩種假定的Tcf/Lef結(jié)合位點(diǎn)。后位突變能夠顯著降低Wnt3a

28、誘導(dǎo)的報(bào)道分子的活性。ChIP試驗(yàn)進(jìn)一步證明在轉(zhuǎn)錄開(kāi)始位點(diǎn)的上游，β-catenin/Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄復(fù)合物能直接與Fra1啟動(dòng)子結(jié)合，并在Wnt3a刺激下，該結(jié)合增強(qiáng)。這些結(jié)果表明Wnt/β-catenin號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)反式激活上調(diào)Fra1的表達(dá)。
　　3.Fra1過(guò)表達(dá)會(huì)下調(diào)上皮標(biāo)記物的表達(dá)并上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)，而沉默F(xiàn)ra1后情況相反。無(wú)論沉默F(xiàn)ra1或β-catenin都會(huì)減弱U-251細(xì)胞的遷移和入侵能力。在膠質(zhì)瘤U-8

29、7細(xì)胞中，敲除β-catenin減弱Wnt3a膠質(zhì)瘤侵襲性的促進(jìn)作用。Wnt3a誘導(dǎo)的U-251cells的遷移和侵襲性在沉默F(xiàn)ra1后而被完全消除。沉默F(xiàn)ra1表達(dá)后后，Wnt3a誘導(dǎo)的EMT-TFs上調(diào)作用明顯減弱。以上的研究結(jié)果表明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Wnt3a誘導(dǎo)的Fra1上調(diào)在EMT中必不可少，而EMT是由Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所誘導(dǎo)。
　　4.膠質(zhì)瘤細(xì)胞在Wnt3a作用下順鉑抵抗值是對(duì)照組的1.67倍。過(guò)表達(dá)的F

30、ra1促進(jìn)順鉑抵抗，IC50是對(duì)照組的1.44倍。然而，沉默F(xiàn)ra1會(huì)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，IC50降低到0.69倍。穩(wěn)定性沉默F(xiàn)ra1并且過(guò)表達(dá)Wnt3a的U-251細(xì)胞與對(duì)照組相比，在激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路會(huì)降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡但在沉默F(xiàn)ra1后，這種抵抗作用沒(méi)有顯示，在上述方法處理的U87的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中也得到了相同的結(jié)果。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)表明Wnt3a過(guò)表達(dá)會(huì)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤對(duì)順鉑的抵抗，

31、并沉默F(xiàn)ra1會(huì)增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。重要的是，F(xiàn)ra1沉默會(huì)抑制Wnt3a對(duì)順鉑的抵抗作用?？傊琖nt/β-連環(huán)蛋白/Fra1軸在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的順鉑抵抗中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　結(jié)論：本研究通過(guò)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行不同濃度Wen3a、沉默β-catenin及Fra-1的處理，然后檢測(cè)EMT相關(guān)的mRNA及蛋白的表達(dá)水平，從而證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能通過(guò)上調(diào)Fra-1的表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。

32、又通過(guò)構(gòu)建不同長(zhǎng)度及Tcf/Lef突變型基因的Fra-1啟動(dòng)子用于熒光酶素反應(yīng)實(shí)驗(yàn)及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)直接結(jié)合來(lái)激活Fra-1轉(zhuǎn)錄，而且發(fā)現(xiàn)β-catenin-Tcf/Lef與WRE的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物位于Fral啟動(dòng)子的近側(cè)區(qū)。通過(guò)體內(nèi)細(xì)胞生存及侵襲實(shí)驗(yàn)，裸鼠瘤體抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同表型下，順鉑的抵抗能力，表明Fra1在介導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤入侵時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵性作用，而神經(jīng)膠質(zhì)瘤入侵是由Wnt/β-cate