阿曼托雙黃酮通過調(diào)控炎癥信號通路預防癲癇發(fā)生及神經(jīng)保護作用研究.pdf

1、癲癇是常見的腦部疾病，以慢性反復自發(fā)性發(fā)作為特征，并常伴有情感和認知功能障礙。目前癲癇的治療仍以藥物治療為主，經(jīng)合理規(guī)范的抗癇藥物治療，有約20%~30%的患者發(fā)作仍得不到有效緩解，這類癲癇被稱為難治性癲癇。顳葉癲癇是成人最常見的難治性癲癇，常繼發(fā)于各種原始的腦損傷并誘導腦內(nèi)級聯(lián)事件發(fā)生，最終導致癲癇易感性增高并產(chǎn)生反復自發(fā)性癲癇發(fā)作，這一過程稱為癲癇發(fā)生（epileptogenesis）。隨著科學技術(shù)的發(fā)展癲癇發(fā)生的概念得到不斷更新，

2、越來越多的臨床和實驗證據(jù)證實，腦內(nèi)炎癥過程是癲癇發(fā)生的一個具有決定性的病理機制，它貫穿于癲癇發(fā)生的各個階段，是其各種病理生理變化的一個共同背景，而最新的共識將癲癇發(fā)生定義為能夠產(chǎn)生自發(fā)性癲癇發(fā)作癥狀后并且伴隨腦組織生長發(fā)育的一種炎癥反應過程。實驗證據(jù)表明癲癇發(fā)生是一個動態(tài)過程，特別是在腦部癲癇易發(fā)區(qū)域，相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)和功能都會出現(xiàn)病理生理學上的持續(xù)變化，導致腦內(nèi)新的病理環(huán)境的產(chǎn)生，最終誘發(fā)癲癇。雖然目前對于癲癇發(fā)生的預防和治療仍存在較大

3、爭議，并且效果有待商榷，但是癲癇發(fā)生與炎癥反應的關(guān)系及機制仍然是臨床與基礎(chǔ)研究關(guān)注的熱點。
　　阿曼托雙黃酮（amentoflavone，AF）是具有多種生物活性的天然多酚類化合物，其在抗炎、抗微生物、抗氧化、抗腫瘤及神經(jīng)保護等方面可以發(fā)揮重要作用。研究證實，AF能夠通過抑制眾多炎性因子而發(fā)揮抗炎作用。其在腫瘤細胞中通過抑制核因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化來抑制腫瘤壞死因子-α（Tumo

4、r necrosis factor，TNF-α）誘導的環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase，COX-2）和前列腺素（Prostaglandins，PG）E2的表達，降低由NF-κB介導的誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）生成一氧化氮（nitric oxide，NO）的能力；在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，AF預處理能夠減輕結(jié)腸黏膜損傷，抑制脂質(zhì)過氧化物、谷胱甘肽（reduced g

5、lutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，顯著降低NO、TNF-α、白細胞介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6、iNOS以及COX-2的水平。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中AF通過調(diào)節(jié)細胞因子如IL-1β和IL-6的表達來促進抗炎反應；AF能夠顯著下調(diào)COX-2蛋白表達水平，抑制重要炎癥介質(zhì)PGE2的合成；此外，AF能夠通過干擾半胱氨酸蛋白酶（Cysteinylaspar

6、tate-specificprotease，Caspase）活化來阻斷細胞凋亡。因此，我們推測AF能夠通過抑制調(diào)控癲癇發(fā)生時腦內(nèi)炎癥通路中的相關(guān)因子，降低神經(jīng)元損傷預防癲癇的發(fā)生。
　　本研究以氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠模型為基礎(chǔ)，應用電生理、行為學、組織學和分子生物學等手段，驗證如下假設(shè)：AF能夠通過抑制膠質(zhì)細胞激活、下調(diào)炎癥通路中相關(guān)因子水平來調(diào)控腦內(nèi)炎癥反應，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，預防癲癇的發(fā)生。
　　第一部分：阿曼托雙

7、黃酮對氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠癲癇易感性和認知功能的影響
　　目的：明確AF預處理對氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇模型癲癇易感性和認知功能的影響。
　　方法：100只SD大鼠隨機分為5組：AF預處理組（pre-AF組）、AF治療組（AF組）、丙戊酸鈉預處理組（pre-VPA組）、癲癇組（EP組）、空白對照組（Control組）。建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型，采用Racine評分評估癲癇模型的發(fā)作等級差異，腦電信號監(jiān)測各組大鼠電

8、生理變化，Morris水迷宮和IntelliCage智能行為學檢測分析系統(tǒng)評價大鼠學習記憶能力，客觀評價AF預處理對致癇大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)（Status epilepticus，SE）和自發(fā)性發(fā)作易感性的影響，明確AF對致癇大鼠癲癇發(fā)生的預防作用。
　　結(jié)果：pre-AF組在造模后少有癲癇發(fā)作，且發(fā)作等級明顯降低，發(fā)作時間縮短，腦電信號顯示癲癇樣波出現(xiàn)的頻率及波幅均明顯降低，行為學和腦電信號表現(xiàn)與 Control組相比無明顯差異。M

9、orris水迷宮定位航行試驗中pre-AF組大鼠逃避潛伏期較AF組、pre-VPA組和EP組縮短（P＜0.05）；在空間探索試驗中，pre-AF組大鼠穿臺次數(shù)比AF組、pre-VPA組和EP組顯著增多（P＜0.05）。IntelliCage行為學檢測顯示，鼻觸學習測試中，與control組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組、EP組的正確訪問（visit）次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與EP組相比，pre-A

10、F組、AF組、pre-VPA組的正確訪問次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中pre-AF組增加次數(shù)最明顯；同時，對鼻戳（nosepoke）正確次數(shù)的觀察中得到了結(jié)果與visit一致；在位置學習測試中，與control組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組、EP組的正確訪問次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與EP組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組的正確訪問次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義

11、（P＜0.05），其中pre-AF組增加次數(shù)最明顯；位置逆轉(zhuǎn)學習測試與位置學習測試結(jié)果相一致；在強化學習測試中，與control組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組、EP組的正確鼻戳次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與EP組相比，pre-AF組、AF組、pre-VPA組的正確鼻戳次數(shù)有明顯改善（P＜0.05），其中pre-AF組改善最明顯；強化逆轉(zhuǎn)學習測試與強化學習測試結(jié)果相一致。
　　結(jié)論：AF的預防性

12、用藥可以降低癲癇大鼠發(fā)作級別、縮短發(fā)作時間、改善空間學習記憶能力的下降，降低癲癇易感性。
　　第二部分：阿曼托雙黃酮對氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷和氧化應激反應的影響
　　目的：研究AF對氯化鋰-匹羅卡品誘導的癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷和氧化應激反應情況，明確其在預防癲癇發(fā)生過程中的作用及可能的機制。
　　方法：雄性SD大鼠100只，分組同第一部分。建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型，應用Nissel染色及TUNE

13、L染色觀察癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷和凋亡情況，免疫組化和Western-Blot技術(shù)檢測大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3的分布和表達水平；同時檢測各組大鼠海馬中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）、GSH水平以及過氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性。
　　結(jié)果：SE后72h，和control組相比

14、，pre-AF組Nissel染色顯示大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)目無明顯差異（P＞0.05）而較EP組明顯增多（P＜0.05）；與control組相比，pre-AF組TUNEL染色顯示大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的陽性細胞數(shù)目均無明顯差異（P＞0.05），較EP組明顯減少（P﹤0.05）；免疫組化顯示，與control組相比，pre-AF組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的caspase-3陽性細胞數(shù)目均無明顯差異（P＞0.05），

15、較EP組明顯減少（P﹤0.05）；Western Blot顯示，pre-AF組與control組caspase-3蛋白表達量無顯著差異（P＞0.05），而較其他各組均顯著降低（P＜0.01）。對各組大鼠海馬氧化應激指標檢測顯示，與control組相比，SE后24h和36h pre-AF組的GSH水平及SOD活力均無明顯差異（P＞0.05），較EP組明顯升高（P﹤0.05）；而pre-AF組CAT、MDA和NO水平與control組相比無

16、明顯差異（P＞0.05），較EP組明顯降低（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：AF預處理通過抑制海馬氧化應激水平降低癲癇誘發(fā)的神經(jīng)元損傷和凋亡，預防癲癇發(fā)生。
　　第三部分：阿曼托雙黃酮對氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活和海馬炎癥反應的影響
　　目的：研究AF對氯化鋰-匹羅卡品誘導的癲癇大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活和海馬氧化應激反應的影響，進一步探討其預防癲癇發(fā)生的機制及神經(jīng)膠質(zhì)細胞在癲癇發(fā)生過程中可能的作用。
　　方

17、法：雄性SD大鼠100只，分組同第一部分。建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型，應用免疫組化觀察大鼠海馬中Iba-1、GFAP的分布和表達，于SE后24h、48h、72h、96h提取大鼠海馬組織，應用Western-Blot技術(shù)檢測炎癥通路中的關(guān)鍵因子NF-κB、COX-2蛋白表達變化，ELISA法檢測下游炎性因子IL-1β、TNF-α、PGE2水平。
　　結(jié)果：免疫組化顯示，AF組、pre-VPA組及EP組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)可見

18、較多Iba-1陽性細胞，與control組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而pre-AF組Iba-1陽性細胞數(shù)量增加明顯減少，與control組相比無明顯差異（P＞0.05）；AF組、pre-VPA組及EP組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)可見較多GFAP陽性細胞，與control組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而pre-AF組GFAP陽性細胞數(shù)量增加明顯減少，與control組相比無明顯差異（P＞0.05）；Western Blot顯

19、示，SE后24h、48h、72h、96h，與control組相比各組大鼠海馬COX-2和NF-κBp65蛋白水平均有不同程度升高，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與EP組相比，pre-AF組蛋白水平均顯著降低，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；除control組以外，各組COX-2和 NF-κB p65蛋白表達在時間順序上呈先高后低的變化趨勢。SE后24h、48h、72h、96h，各組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、PGE2和TNF