Nrf2-ARE信號通路在癲癇腦損傷中的作用及萊菔硫烷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是多種病因?qū)е碌穆阅X部病變，以大腦神經(jīng)元過度地、反復(fù)超同步化放電為特征，臨床表現(xiàn)為短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的綜合征。癲癇反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致腦部神經(jīng)元選擇性損傷，甚至壞死丟失，從而引起膠質(zhì)細(xì)胞增生、突觸重構(gòu)等腦結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化;而大腦這些可塑性變化又使癲癇反復(fù)發(fā)作，是癲癇難治的主要原因之一，反復(fù)癲癇發(fā)作的患者常伴有認(rèn)知功能損傷，其發(fā)生率約為30％-40％。
　　癲癇的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，迄今尚未完

2、全闡明，氧化應(yīng)激損傷、谷氨酸興奮性毒性、鈣超載等多種因素都能誘導(dǎo)神經(jīng)元異常放電觸發(fā)癲癇。其中氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基連鎖反應(yīng)是神經(jīng)元受損的核心病理環(huán)節(jié)。近年的研究結(jié)果證實(shí)，許多慢性疾病都與人體內(nèi)氧化應(yīng)激發(fā)生，累積過多的自由基(Free Radical，F(xiàn)R)有關(guān)，癲癇與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系日益成為科研工作者研究的熱點(diǎn)。無論是癲癇動物模型還是癲癇患者的腦內(nèi)均存在著活躍的氧化應(yīng)激反應(yīng)，癲癇發(fā)作時(shí)FR含量明顯增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過機(jī)體對FR的清除能力。大

3、量的FR可以直接使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA等大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷，從而破壞細(xì)胞膜及其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時(shí)FR還能通過抑制線粒體功能引起細(xì)胞凋亡。因此，針對氧自由基在癲癇腦損傷病理機(jī)制中重要作用，抑制氧化應(yīng)激和清除氧自由基可能是治療癲癇的重要策略。
　　轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(NF-E2-related factor2，Nrf2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，通過與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responseelemen

4、t，ARE)相互作用調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。Nrf2是機(jī)體調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，正常生理情況下位于細(xì)胞漿中，在細(xì)胞漿中與Keapl結(jié)合形成復(fù)合體，且被泛素蛋白酶迅速降解，從而保持其低活性的生理狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到氧自由基和內(nèi)源性毒素等攻擊后Nrf2與Keapl解離，其半衰期明顯延長，然后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合后誘導(dǎo)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)。到目前為止，已證實(shí)經(jīng)Nrf2-ARE信號路徑調(diào)節(jié)的可編碼

5、內(nèi)源性保護(hù)基因超過200個。它們在增強(qiáng)組織抗氧化能力、保護(hù)組織細(xì)胞免受毒物損傷、抗腫瘤、抗炎癥和抗凋亡中起著重要的作用，其中血紅素氧合酶1(hemeoxygenase1，HO-1)和依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1(NADPH:quinone oxidoreductase1，NQO1)是該通路編碼的重要的抗氧化酶。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上調(diào)HO-1和NQO1的表達(dá)，能夠減少氧自由基和內(nèi)源性毒素對神經(jīng)元的毒性作用。既往研究證實(shí)，激活Nrf2-AR

6、E信號通路上調(diào)其基因產(chǎn)物的表達(dá)對神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、腦出血、腦梗死和腦外傷等，具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)功能。但是，Nrf2-ARE信號通路在癲癇發(fā)病中表達(dá)改變，及其對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用還未見明確相關(guān)報(bào)道。
　　萊菔硫烷(Sulforaphane，SF)是一種廣泛存在于十字花科蔬菜的異硫氰酸鹽，具有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)特性，作為化學(xué)預(yù)防藥物已引起廣大研究者的關(guān)注。既往研究證實(shí)，SF是Nrf2-ARE信號通路重要的激活

7、劑，能夠誘發(fā)Nrf2磷酸化轉(zhuǎn)位入核，與ARE結(jié)合，正向調(diào)控抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，清除自由基從而對機(jī)體細(xì)胞起到保護(hù)作用。但SF對癲癇的神經(jīng)保護(hù)作用及其具體分子機(jī)制尚未見明確報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)主要采用杏仁核電點(diǎn)燃癲癇大鼠模型，觀察癲癇大鼠模型海馬組織中氧化應(yīng)激參數(shù)（丙二醛和谷胱甘肽）的表達(dá)改變;Nrf2及其編碼的基因產(chǎn)物HO-1和NQO1的表達(dá)改變;同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證以Nrf2-ARE信號通路為靶點(diǎn)的藥物SF對海馬組織氧化應(yīng)激的改

8、善情況及對神經(jīng)元的保護(hù)作用。為闡明癲癇的病理生理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為癲癇治療提供新的靶點(diǎn)，為抗癲癇藥物的選擇提供新的思路。
　　第一部分、Nrf2-ARE信號通路在急性電點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬的表達(dá)及意義
　　目的:觀察急性電點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激參數(shù)（丙二醛和谷胱甘肽）及Nrf2-ARE信號通路的表達(dá)改變，以期為癲癇的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法:采用杏仁核快速電點(diǎn)燃制備急性癲癇大鼠模型（每天刺激20次，刺激間

9、隔時(shí)間10min，連續(xù)刺激2d，刺激電流為恒流，單向方波。），通過分光光度法檢測大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激參數(shù)（丙二醛和谷胱甘肽）表達(dá)改變;通過免疫組化和Western blot方法觀察Nrf2、HO-1和NQO1在海馬組織中蛋白水平的表達(dá)改變;同時(shí)通過Real-time PCR方法觀察Nrf2mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA在海馬組織中基因水平的表達(dá)改變。
　　結(jié)果:
　　1.氧化應(yīng)激參數(shù)的改變:與對照組相比，

10、癲癇組大鼠海馬組織中谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量明顯降低(P＜0.01)。與對照組相比，癲癇組大鼠海馬組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平明顯升高(P＜0.01)。假手術(shù)組與對照組相比GSH與MDA差別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.免疫組化結(jié)果:Nrf2免疫反應(yīng)在海馬的錐體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿和胞核均有表達(dá);HO-1免疫反應(yīng)主要在海馬錐體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿。對三組大鼠

11、海馬CA1、CA2和CA3區(qū)Nrf2和HO-1表達(dá)的平均光密度值(AOD)測量，癲癇組比對照組AOD值明顯增高(P＜0.01);假手術(shù)組和對照組相比，AOD值差別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.Western-blot結(jié)果:3.1、電點(diǎn)燃大鼠海馬組織胞核內(nèi)的Nrf2的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而在對照組和假手術(shù)組Nrf2表達(dá)相對較弱，Nrf2與H3免疫印跡條帶相對吸光度比值電點(diǎn)燃組比對照組明顯增加，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01

12、)。假手術(shù)組和對照組相比沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。3.2、電點(diǎn)燃大鼠海馬組織胞漿內(nèi)的HO-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而在對照組和假手術(shù)組HO-1表達(dá)相對較弱，HO-1與β-actin免疫印跡條帶相對吸光度比值，電點(diǎn)燃組比對照組明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。假手術(shù)組的吸光度比值和對照組相比沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4.Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果:各組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1和NQO1mR

13、NA的表達(dá)水平以三種物質(zhì)mRNA/GAPDHmRNA表示，與對照組Nrf2、HO-1和NQO1mRNA表達(dá)水平相比，電點(diǎn)燃組Nrf2、HO-1和NQO1mRNA表達(dá)水平明顯增高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);假手術(shù)組Nrf2、HO-1和NQO1mRNA表達(dá)水平和對照組表達(dá)水平相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:急性癲癇發(fā)作可以導(dǎo)致海馬組織發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物MDA含量增高和自由基清除劑GSH含量降低

14、;急性癲癇發(fā)作可以誘導(dǎo)海馬組織中Nrf2和其編碼的基因產(chǎn)物HO-1和NQO1在蛋白和基因水平表達(dá)明顯增強(qiáng)。說明Nrf2-ARE信號通路與癲癇發(fā)病關(guān)系密切，可能是癲癇治療的新的靶點(diǎn)。
　　第二部分、萊菔硫烷對慢性電點(diǎn)燃癲癇大鼠的腦保護(hù)作用研究
　　目的:觀察萊菔硫烷對慢性電點(diǎn)燃癲癇大鼠的抗癲癇作用及對認(rèn)知功能的影響;同時(shí)觀察其對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　方法:采用慢性杏仁核電點(diǎn)燃制備癲癇大鼠模型（每天電刺激1次，連續(xù)刺

15、激15d，刺激電流為恒流，單向方波。），在點(diǎn)燃過程中給予大鼠腹腔注射SF（5mg/kg/day）。通過對大鼠點(diǎn)燃過程中發(fā)作等級和后放電持續(xù)時(shí)間（afterdischarge duration，ADD）比較，觀察SF的抗癲癇作用;通過Morris水迷宮監(jiān)測癲癇大鼠的認(rèn)知功能及SF對其的改善作用;通過尼氏染色和透射電鏡觀察癲癇大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變及SF的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　結(jié)果:
　　1.SF對慢性癲癇模型點(diǎn)燃過程的影響在連

16、續(xù)給與15次亞驚厥電刺激的過程中，所有的大鼠均出現(xiàn)了不同程度的癲癇發(fā)作。連續(xù)15次電刺激后，在電點(diǎn)燃組中所有的大鼠均達(dá)到了完全點(diǎn)燃的標(biāo)準(zhǔn)（連續(xù)出現(xiàn)3次4-5級發(fā)作），而在電點(diǎn)燃+SF組的大鼠中僅有4只達(dá)到了點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)。對兩組大鼠的發(fā)作等級比較后發(fā)現(xiàn)在第9-15天的時(shí)候具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（在第9-14天時(shí)P＜0.05，在第15天時(shí)P＜0.01）。同時(shí)，連續(xù)給予15次電刺激過程中所有大鼠的ADD逐漸延長，比較電點(diǎn)燃組和電點(diǎn)燃+SF組發(fā)現(xiàn)，在

17、第7-15天的時(shí)候具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（在第9-10天時(shí)P＜0.05，在第11-15天時(shí)P＜0.01）。對照組和SF組沒有出現(xiàn)癲癇發(fā)作。
　　2.Morris水迷宮檢測結(jié)果
　　2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果:每日逃避潛伏期取其平均值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，(1)對照組、電點(diǎn)燃組、SF+電點(diǎn)燃組和SF組四組大鼠的逃避潛伏期在第1和2天無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在第1和2天，與對照組大鼠的逃避潛伏期相比較，電點(diǎn)燃組大鼠及SF+電點(diǎn)燃

18、組大鼠的逃避潛伏期均有延長趨勢。(2)實(shí)驗(yàn)第3、4、5天，各組逃避潛伏期均比第1、2天有縮短趨勢，在第3、4和5天，與對照組大鼠的逃避潛伏期相比較，電點(diǎn)燃組大鼠的逃避潛伏期均明顯延長(P＜0.05);SF+電點(diǎn)燃組大鼠的逃避潛伏期較電點(diǎn)燃組大鼠均明顯縮短(P＜0.05)，但與對照組比較仍明顯延長(P＜0.05);SF組大鼠的逃避潛伏期和對照組沒有明顯變化(P＞0.05)。
　　2.2 空間探索試驗(yàn)結(jié)果:電點(diǎn)燃組大鼠120 s內(nèi)穿越

19、平臺區(qū)域的次數(shù)明顯低于對照組(P＜0.01);SF+電點(diǎn)燃組大鼠120s內(nèi)穿越平臺區(qū)域的次數(shù)與電點(diǎn)燃組比較次數(shù)均明顯增多(P＜0.01)。在平臺象限的游泳時(shí)間為:與對照組相比，電點(diǎn)燃組明顯減少(P＜0.01)，SF+電點(diǎn)燃組在平臺象限的游泳時(shí)間與電點(diǎn)燃組比較明顯增多(P＜0.01)，SF組和對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.尼氏染色結(jié)果:對照組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)完整、核仁清晰，胞漿內(nèi)尼氏體豐富，錐體細(xì)胞排列規(guī)則緊密

20、，沒有明顯神經(jīng)元丟失;與對照組相比，電點(diǎn)燃組大鼠海馬神經(jīng)元丟失明顯，排列紊亂，可見細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝集成塊、核固縮、尼氏體數(shù)量減少;SF治療后海馬組織神經(jīng)元邊緣清晰，神經(jīng)元沒有明顯丟失，結(jié)構(gòu)正常，僅少量染色質(zhì)凝集、尼氏體數(shù)量較癲癇組顯著增加。SF單獨(dú)用藥組海馬組織神經(jīng)元和對照組沒有明顯改變。
　　4.透射電極觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化:對照組電鏡觀察:神經(jīng)元形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰。胞核呈圓形，染色質(zhì)均勻分布。胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見線

21、粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和大量的多核糖體。線粒體呈圓形或橢圓形，嵴清晰可見。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)達(dá)。軸突中神經(jīng)微絲微管清晰可見。突觸前、后膜結(jié)構(gòu)清晰，突觸前膜靠近突觸間隙一側(cè)有較多圓形的突觸囊泡，突觸間隙清晰。電點(diǎn)燃組電鏡觀察:海馬神經(jīng)元胞核腫脹、形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)減少分散，胞核疏松、透明，有些出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象。線粒體空泡化或均質(zhì)化。神經(jīng)微絲微管結(jié)構(gòu)不清，可見聚集。突觸前、后膜結(jié)構(gòu)模糊不清，突觸間隙增大，靠近突觸前膜的突觸囊泡

22、減少。SF+電點(diǎn)燃組電鏡觀察:海馬神經(jīng)元核膜完整，核形態(tài)基本正常，染色質(zhì)均勻分布，胞質(zhì)中細(xì)胞器形態(tài)基本正常，有髓神經(jīng)髓鞘完整。突觸數(shù)量較多，形態(tài)接近于正常。突觸前、后膜結(jié)構(gòu)清楚，突觸間隙清晰，突觸前膜的突觸囊泡較多。SF單組用藥組電鏡觀察和正常對照組超微結(jié)構(gòu)沒有明顯改變。
　　結(jié)論:本研究通過給慢性電點(diǎn)燃大鼠腹腔注射SF后發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗癲癇效果，同時(shí)對癲癇大鼠認(rèn)知損傷也有一定的改善作用。進(jìn)一步對癲癇模型海馬組織的大體形態(tài)和超微

23、結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，SF能有效防止癲癇發(fā)作對海馬神經(jīng)元的損傷。
　　第三部分、萊菔硫烷對慢性電點(diǎn)燃癲癇大鼠腦保護(hù)作用的機(jī)制研究
　　目的:觀察SF對癲癇大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激和對Nrf2-ARE信號通路及其基因產(chǎn)物HO-1和NQO1表達(dá)的影響，探討SF的腦保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法:采用杏仁核慢電點(diǎn)燃制備慢性癲癇大鼠模型（每天電刺激1次，連續(xù)刺激15d，刺激電流為恒流，單向方波），同時(shí)在點(diǎn)燃過程中給予SF（5mg/kg/day

24、）腹腔注射，通過分光光度法檢測大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激參數(shù)（GSH和MDA）表達(dá)改變;通過Western blot實(shí)驗(yàn)方法觀察Nrf2、HO-1和NQO1在海馬組織中蛋白水平的表達(dá)改變;同時(shí)通過Real-time PCR實(shí)驗(yàn)方法觀察Nrf2mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA在海馬組織中基因水平的表達(dá)改變。
　　結(jié)果:
　　1.氧化應(yīng)激參數(shù)GSH和MDA含量比較與對照組相比，電點(diǎn)燃組大鼠海馬組織中GSH含量明顯降低

25、(P＜0.01);與正常對照組相比，電點(diǎn)燃組大鼠海馬組織中MDA水平明顯升高(P＜0.01)。SF治療后明顯升高了電點(diǎn)燃組大鼠海馬組織中GSH水平(P＜0.01)，明顯降低了電點(diǎn)燃組大鼠海馬組織中MDA水平(P＜0.01)。SF單獨(dú)用藥組與對照組相比MDA明顯降低(P＜0.01)， GSH明顯增高(P＜0.01)。
　　2.Western blot檢測Nrf2、HO-1和NQO1在海馬組織中的表達(dá)改變Nrf2蛋白表達(dá)水平以H3作為

26、參照，電點(diǎn)燃組大鼠與正常對照組相比，Nrf2水平?jīng)]有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05); SF治療后可顯著升高癲癇大鼠海馬組織中Nrf2蛋白水平(P＜0.01);與對照組相比，單獨(dú)SF用藥組也使Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.01)。
　　HO-1和NQO1蛋白表達(dá)水平以β-actin作為參照，癲癇組大鼠與正常對照組相比，HO-1和NQO1表達(dá)水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);SF治療后可顯著增高癲癇大鼠海馬組織中HO-1和

27、NQO1蛋白水平(p＜0.01);與對照組相比，單獨(dú)SF組也使大鼠海馬組織中HO-1和NQO1蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.01)。
　　3.Real-time PCR檢測Nrf2、HO-1和NQO1mRNA在海馬組織的表達(dá)改變Nrf2、HO-1和NQO1mRNA表達(dá)水平以GAPDHmRNA作為參照。電點(diǎn)燃組大鼠與正常對照組相比，Nrf2mRNA、HO-1mRNA和NQO1mRNA水平?jīng)]有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05); SF治療

28、后可顯著升高癲癇大鼠海馬組織中Nrf2mRNA、HO-1 mRNA和NQO1mRNA表達(dá)(P＜0.01);與對照組相比，單獨(dú)SF組也使大鼠海馬組織中Nrf2mRNA、HO-1mRNA和NQO1mRNA表達(dá)水平明顯增高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:SF能有效激活海馬組織中Nrf2-ARE信號通路，同時(shí)改善癲癇發(fā)作導(dǎo)致的氧化應(yīng)激狀態(tài)，這可能是其腦保護(hù)的作用機(jī)制。該研究為闡明SF的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為抗癲癇藥物的選擇提供