CREB信號通路調控宮內炎癥后仔鼠海馬神經發(fā)生及分子機制研究.pdf

1、圍產期胎兒炎癥反應綜合征(Fetal Inflammatory Response Syndrome，FIRS)是造成早產和早產兒腦白質損傷的最常見原因，臨床與流行病學資料證實早產兒腦白質損傷是兒童腦癱的一個重要危險因素。由于早產兒腦自質損傷將影響神經系統發(fā)育，所以腦損傷后神經再生修復機制的研究將顯得尤為重要。cAMP反應序列結合蛋白(CREB)是一種重要的核轉錄因子，調節(jié)啟動子中具有環(huán)磷酸腺苷反應單元(CRE)的基因轉錄，在神經元再生、

2、突觸形成及學習記憶等方面具有重要的調節(jié)作用，是細胞內多種信號通路的一種關鍵成分。雖然國內外研究發(fā)現，缺氧缺血能誘導海馬神經發(fā)生，但是對宮內炎癥仔鼠腦白質損傷后海馬神經發(fā)生的研究目前很少涉及，而且CREB信號通路是否參與腦白質損傷后海馬神經發(fā)生和認知損害修復的分子機制尚不明確。本研究通過建立宮內炎癥后仔鼠腦白質損傷模型，研究仔鼠生后不同時間點海馬神經發(fā)生的規(guī)律；以及研究CREB信號通路是否參與腦白質損傷后海馬神經發(fā)生；而且通過PI3K抑制

3、劑LY294002和PDE4抑制劑Rolipram干預，探討CREB信號通路在宮內炎癥仔鼠腦白質損傷后海馬神經發(fā)生中的作用和分子機制。從腦損傷自身修復角度進一步闡述CREB信號通路在神經發(fā)生及認知功能改善中的作用和分子機制，為防治早產兒腦白質損傷和兒童腦癱的康復提供理論依據。
　　目的：
　　研究宮內炎癥腦白質損傷后仔鼠生后不同時間點海馬神經發(fā)生的規(guī)律，明確CREB信號通路是否參與調節(jié)腦白質損傷后海馬神經發(fā)生，解釋CREB信

4、號通路在宮內炎癥腦白質損傷后海馬神經發(fā)生中的作用和分子機制，闡明CREB信號通路在官內炎癥腦白質損傷后海馬神經發(fā)生及認知功能改善中的重要意義。
　　方法：
　　1.動物模型：實驗動物分2組：①空白對照組：在各時間點和實驗組等數量配對，②官內炎癥組：SD雌鼠孕15天于左右兩側宮頸內各注射大腸桿菌稀釋液0.2mL，待其生產，制備宮內炎癥后仔鼠腦白質損傷模型。各組仔鼠在不同時間點腹腔注射BrdU，24h后行主動脈灌注固定后制備3、

5、7、14、28日齡腦組織石蠟標本，用免疫組織化學法檢測BrdU陽性的增殖細胞數目變化；7日齡腦組織采用免疫熒光雙標記(BrdU/Nestin)檢測海馬齒狀回神經干細胞增殖情況；28日齡腦組織采用免疫熒光雙標記(BrdU/NeuN、BrdU/GFAP)檢測海馬齒狀回神經元與星形膠質細胞分化情況。
　　2.Morris水迷宮法：水迷宮的水池直徑為100cm，高60cm，水深51cm，水溫(22±0.5)℃，站臺高度為50cm，站臺頂端

6、平面10cm×10cm，平臺沒于水面下1cm，水池周圍參照物保持不變。實驗包括：①適應性訓練：實驗前1d讓動物在無安全平臺的水中適應性游泳2min；②定位航行試驗：實驗歷時5d，每日分上、下午系列，每個系列包括4次，操作者將大鼠面向池壁從不同象限入水，發(fā)現平臺后，讓其在平臺上站立30s，將大鼠從平臺上拿下來休息60s，再隨機由下一象限入水進行試驗，如果120s內找不到平臺，則由操作者幫助其上平臺，潛伏期記為最高分120s。記錄大鼠找到平

7、臺的時間(逃避潛伏期)；③空間探索試驗：第6天，撤去平臺，取隨機一點投大鼠入水池中，記錄2min內大鼠穿過平臺所在象限的時間。④探索實驗結束后，休息三天，即水迷宮的第10天，再對全部大鼠進行一次水迷宮測試，方法同定位航行試驗，測試其遠期記憶的保持能力。
　　3.CREB信號通路與神經發(fā)生：官內炎癥組和空白對照組動物在相應時間點(3、7、14、21、28日齡)斷頭取腦，應用RT-PCR及Western blot檢測海馬齒狀回p-Ak

8、t、Survivin、p-CREB、BDNF、TrkB mRNA和蛋白質表達變化；應用免疫組化在28日齡對p-Akt、p-CREB、BDNF進行定位染色，進一步明確CREB信號通路的主要基因p-Akt、p-CREB和BDNF在海馬齒狀回神經細胞的表達情況。通過以上方法證明CREB信號通路參與宮內炎癥腦白質損傷后海馬神經發(fā)生。
　　4.CREB信號通路干預：宮內炎癥組和空白對照組動物側腦室微量注射PI3K阻滯劑LY294002阻斷P

9、I3K/Akt信號通路，同時應用磷酸二酯酶(PDE4)抑制劑Rolipram，增加腦內cAMP濃度從而激活CREB信號通路.兩組動物分別在28日齡進行Morris水迷宮實驗觀測仔鼠學習記憶能力改變，并通過激光共聚焦顯微鏡研究相應年齡點仔鼠海馬齒狀回神經細胞增殖和分化的變化，以及通過Westernblot檢測CREB信號通路主要組分p-Akt、p-CREB及BDNF蛋白的表達變化，進一步闡述CREB信號通路參與腦白質損傷后海馬神經發(fā)生的分

10、子機制。
　　結果：
　　1.宮內炎癥組子宮及胎盤內血管充血、水腫，并見大量中性粒細胞浸潤；宮內炎癥組仔鼠腦白質出現彌漫性病理改變，表現為結構稀疏、呈篩網狀，少數出現嚴重的凝固性壞死和囊狀病變。
　　2.定位航行實驗結果顯示官內炎癥組仔鼠游泳軌跡雜亂無章，逃避潛伏期較空白對照組顯著延長(P<0.05)；經過尋找隱藏平臺訓練，兩組動物的逃避潛伏期均有所下降，第4天以后兩組動物的逃避潛伏期無顯著性差異(P>0.05)。空間

11、探索實驗結果顯示官內炎癥組仔鼠的穿越平臺次數較空白對照組顯著減少(P<0.05)，而且宮內炎癥組仔鼠的遠期記憶保持能力較空白對照組降低，逃避潛伏期較空白對照組顯著延長(P<0.05)。
　　3.宮內炎癥組新生3，7，14日齡(P3，7，14)仔鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞數較同日齡對照組顯著增加(P<0.05)，28日齡(P28)仔鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞數與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。官內炎癥組新生7日齡(P7)

12、仔鼠海馬齒狀回BrdU+/Nestin+細胞數較對照組顯著增加(P<0.01)。宮內炎癥組新生28日齡(P28)仔鼠海馬齒狀回BrdU+/NeuN+、BrdU+/GFAP+細胞數與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。
　　4.宮內炎癥組仔鼠海馬P-Akt mRNA和蛋白質表達與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，于3，7，14日齡(P3，7，14)表達顯著升高(P<0.05)。官內炎癥組仔鼠海馬p-CREB mRNA和蛋

13、白質表達與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，于14，28日齡(P14，28)表達顯著升高(P<0.05)。官內炎癥組仔鼠海馬BDNFmRNA和蛋白質表達與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，于3，7日齡(P3，7)表達顯著升高(P<0.05).免疫組化顯示p-Akt、p-CREB、BDNF在海馬齒狀回有定位表達。
　　5.予LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路發(fā)現LY294002組仔鼠逃避潛伏期較對照組顯著延長(

14、P<0.05)，經過5天的尋找隱藏平臺訓練，LY294002組的逃避潛伏期未見顯著下降，并在第10天表現了較差的記憶保持能力，兩組比較有顯著性差異(P<0.05)。LY294002組仔鼠海馬齒狀回BrdU+/Nestin+細胞數較對照組顯著減少(P<0.05)。LY294002組仔鼠海馬p-Akt、p-CREB和BDNF蛋白質表達較對照組顯著降低(P<0.05)。應用磷酸二酯酶(PDE4)抑制劑Rolipram激活CREB信號通路，發(fā)現

15、LY294002+Rolipram組仔鼠逃避潛伏期較LY294002+生理鹽水組顯著縮短(P<0.05)，經過5天的尋找隱藏平臺訓練，LY294002+Rolipram組仔鼠的逃避潛伏期顯著下降，并在第10天表現了良好的記憶保持能力，與LY294002+生理鹽水組比較有顯著性差異(P<0.05)，而與空白對照+生理鹽水組比較無顯著性差異(P>0.05).而且實驗發(fā)現LY294002+Rolipram組仔鼠海馬齒狀回BrdU+/Nesti

16、n+細胞數較LY294002+生理鹽水組顯著增加(P<0.05)。LY294002+Rolipram組仔鼠海馬p-Akt、P-CREB和BDNF蛋白質表達較LY294002+生理鹽水組顯著增加(P<0.05)。
　　結論：
　　1.宮內炎癥腦白質損傷可以造成學習記憶和認知功能缺陷；宮內炎癥組仔鼠海馬齒狀回BrdU+細胞數和BrdU+/Nestin+細胞數顯著增加，表明腦白質損傷可以誘導海馬神經發(fā)生；經過5天尋找隱藏平臺訓練，

17、宮內炎癥組仔鼠的逃避潛伏期顯著下降，表明腦白質損傷后機體存在自身修復機制，可以改善學習記憶和認知功能缺陷。
　　2.宮內炎癥組仔鼠海馬p-Akt、p-CREB與BDNFmRNA和蛋白質表達較對照組顯著性升高，而且發(fā)現p-Akt、p-CREB、BDNF在海馬齒狀回有定位表達情況，說明CREB信號通路參與調節(jié)宮內炎癥腦白質損傷后海馬神經發(fā)生。
　　3.LY294002能減少海馬神經發(fā)生、加重學習記憶和認知功能缺陷并降低p-Akt