重組人血管內皮抑素在博來霉素誘導肺纖維化大鼠模型中的作用及機制研究.pdf

1、重組人血管內皮抑素在博來霉素誘導肺纖維化大鼠模型中的作用及機制研究
　　 研究背景與目的:
　　 特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)是最常見的肺間質疾病，也是呼吸系統(tǒng)最嚴重疾病之一，病程一般呈進行性發(fā)展，最終可以引起呼吸衰竭而死亡，其5年生存率不超50％，因此受到許多國內外學者的關注。IPF發(fā)病機制不明，治療效果差。研究其發(fā)病機制，拓展新的治療措施具有重要意義。
　　

2、 近年來血管生成在肺纖維化發(fā)生中的作用日益受到重視，血管生成可能是肺纖維化形成過程中的一個關鍵環(huán)節(jié)。很多研究發(fā)現在博來霉素誘導的肺纖維化動物模型中，抑制促血管生成因子或給予抗血管生成因子干預減輕血管生成能改善肺纖維化的進展。血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是目前已知的最主要的血管生成因子，能夠促進新血管的生成，增加血管通透性，并參與炎細胞浸潤、維持其存活和促進轉化生長因子β1(

3、transforminggrowthfactorβ1，TGFβ1)表達等，VEGF受體2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，VEGFR2)是VEGF發(fā)揮功能的主要受體。VEGF在肺纖維化形成中過度表達。抑制VEGF/VEGFR2通路可能通過抑制異常血管生成改善肺纖維化。
　　 VEGF能激活細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellularsignalregulatedkinase，E

4、RK)。ERK1/2是目前發(fā)現的一個重要的細胞增殖信號調節(jié)蛋白，能調控血管內皮形態(tài)及多種炎性介質和細胞因子的表達。ERK1/2激活后可以轉移到細胞核內，磷酸化一系列轉錄因子包括核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)，進而調控下游蛋白轉錄表達。NF-κB在炎癥反應調控中起核心作用，參與調控許多細胞因子表達，包括促炎因子腫瘤壞死因子-α(tumournecrosisfactor-α，TNF-α)和促纖維化因子TGFβ1

5、。
　　 內皮抑素能抑制VEGF/VEGFR2通路，在其他疾病研究中對于抑制ERK1/2和NF-κB活化、下調TNF-α和TGFβ1表達的作用也有報道?；谝陨贤芳凹毎蜃釉诜卫w維化過程中的重要作用，推測應用內皮抑素干預血管形成及炎癥反應可能改善肺纖維化進展。本研究將建立博來霉素(bleomycin，BLM)誘導的大鼠肺纖維化模型，給予重組人血管內皮抑素(recombinanthumanendostatin，rhES)皮下注射

6、，觀察血管形成、炎癥及纖維化改變，探討內皮抑素對肺纖維化的可能的作用機制。
　　 方法:
　　 1.肺纖維化模型建立:將博來霉素經氣管注入SD大鼠，觀察動物一般情況及不同時期肺組織切片HE染色及Masson染色，確定成功制備肺損傷纖維化模型。
　　 2.對血管形成、炎癥及肺纖維化的影響:實驗動物分為正常對照組(生理鹽水，SAgroup)，博來霉素模型組(BLMgroup)，早期rhES組(BLM+前14天rhES

7、，E-ESgroup)、晚期rhES組(BLM+后14天rhES，L-ESgroup)及全程rhES組(BLM+28天rhES，W-ESgroup)。每組15只大鼠，分別于7天、14天、28天各處死5只。應用HE染色、Masson染色及羥脯氨酸測定研究肺纖維化大鼠模型肺損傷不同階段肺部炎癥及纖維化改變;測定支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)中白細胞計數及Wright-Giemsa染色觀察白

8、細胞分類改變，并測定BALF蛋白與血清總蛋白濃度，計算血管通透指數(proteinpermeabilityindex，PPI);免疫組織化學方法測量微血管密度(microvasculardensity，MVD)。
　　 3.機制研究:免疫組織化學方法測定VEGFR2蛋白表達;酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linkedimmunesorbentassay，ELISA)分別測量肺組織勻漿VEGF、TGF-β1及BALF中TNF-α表達

9、。實時熒光定量PCR分析VEGF、VEGFR2mRNA水平表達;Westernblot法分析ERK1/2及NF-κB的激活。
　　 4.結果統(tǒng)計:應用軟件SPSS18.0進行數據統(tǒng)計，所有計量數據都用均數±標準差來表示，采用雙因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.動物模型建立:正常大鼠鏡下見肺結構清晰正常，各觀察時期無結構改變，無炎細胞浸潤及膠原纖維沉積。給予博

10、來霉素氣管內灌注后，第7天見肺泡間隔增寬，病灶區(qū)域內巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤明顯，少量膠原纖維沉積;14天肺泡間隔明顯增寬，仍有大量炎性細胞浸潤但較前減輕，成纖維細胞及膠原纖維增多;第28天可見肺泡結構破壞紊亂，肺間質纖維成分大量沉積，炎癥細胞較前減少。
　　 2.動物一般情況觀察:SA組大鼠活潑強壯，皮毛光亮，攝食正常，體重逐漸增加;BLM組死亡1只，有咳喘，皮毛無光澤，精神差，攝食減少，體重較SA組明顯下降(P＜0

11、.001)，后期體重略有增加。E-ES和W-ES組大鼠早期有咳喘，攝食減少，體重下降較BLM組減少(P＜0.05);L-ES組大鼠表現同BLM組，體重變化較BLM組無統(tǒng)計學差異。
　　 3.病理學改變:SA組各觀察時期肺組織無明顯炎癥細胞浸潤和纖維沉積。BLM組早期見肺泡間隔增寬，病灶區(qū)域炎癥細胞浸潤明顯，少量膠原纖維沉積;晚期肺泡結構破壞明顯，肺間質內大量藍色膠原纖維沉積，炎癥細胞浸潤較早期減少。E-ES和W-ES組HE染色及

12、Masson染色顯示第7、14天肺泡炎較BLM組明顯減輕（day7:P＜0.001，day14:P＜0.05），纖維化評分第14、28天較BLM組明顯減低（day14:P＜0.05，day28:P＜0.001）。L-ES組大鼠肺泡炎及纖維化評分較BLM組大鼠無明顯統(tǒng)計學差異。
　　 4.羥脯氨酸測定:SA組大鼠肺羥脯氨酸含量各觀察時間段無明顯變化。BLM造模后各觀察時間段均較SA組明顯升高（P＜0.001）。E-ES和W-ES組

13、羥脯氨酸含量較BLM組均明顯下降(day7:P＜0.01，day14和day28:P＜0.001)。L-ES組羥脯氨酸含量較BLM組低，但尚無統(tǒng)計學意義(day28:P=0.09)。
　　 5.MVD:SA組各觀察時間段肺微血管密度無明顯變化。BLM造模后第7天新生血管明顯增多，第14和28天逐漸下降(P＜0.001)。E-ES和W-ES組各觀察時間段MVD較BLM組降低，L-ES組MVD較BLM組無明顯變化。
　　 6

14、.BALF炎癥細胞計數及分類:SA組各觀察時間段BALF炎癥細胞計數及分類無變化。BLM造模后BALF中白細胞總數、中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞計數均明顯升高（P值均＜0.05）。E-ES和W-ES組第7和14天白細胞總數、中性粒細胞及巨噬細胞計數較BLM組均明顯下降（P＜0.05），淋巴細胞計數在各觀察時間段較BLM組無明顯變化。L-ES組炎癥細胞計數及分類較BLM組無統(tǒng)計學差異。
　　 7.PPI:SA組各觀察時間段PPI

15、無變化。BLM組PPI第7天明顯升高，第14和28天逐漸下降（P＜0.001）。E-ES和W-ES組PPI較BLM組降低（day7和day14:P＜0.001，day28:P＜0.05）。L-ES組PPI較BLM組無統(tǒng)計學差異。
　　 8.VEGF及VEGFR2mRNA與蛋白水平表達變化:BLM組各觀察時段VEGF及VEGFR2mRNA水平較SA組明顯增高，以第7天為著，第14和28天逐漸下降(day7和day14:P＜0.00

16、1,day28:P＜0.05)。E-ES和W-ES組VEGF/VEGFR2mRNA表達較BLM組降低（P值均＜0.05）。L-ES組VEGF及VEGFR2mRNA表達較BLM組無統(tǒng)計學差異。肺勻漿VEGF濃度及VEGFR2免疫組化評分變化同mRNA水平變化。
　　 9.TNF-α表達:SA組各觀察時間段TNF-α表達水平無明顯變化。BLM造模后TNF-α第7天明顯升高，第14和28天逐漸下降(P＜0.001);E-ES和W-ES

17、組TNF-α水平較BLM組在各觀察時期均明顯下降(P＜0.001);L-ES組第28天TNF-α水平較BLM組也下降（P＜0.05）。
　　 10.TGF-β1表達:BLM組TGF-β1表達較SA組明顯升高，第14天最顯著，第28天略有下降（P＜0.001）;早期應用內皮抑素能顯著抑制TGF-β1升高(P＜0.001);晚期應用內皮抑素后TGF-β1表達較BLM組降低，但尚無統(tǒng)計學差異（day28:P=0.142）。
　　

18、 11.pERK1/2和總ERK1/2:BLM造模后各組pERK1/2表達均較SA組明顯升高(P值均＜0.05);E-ES和W-ES組pERK1/2表達第7、14天明顯低于BLM組和L-ES組（day7:P＜0.001，day14:P＜0.05），第28天各組間無統(tǒng)計學差異;L-ES組和BLM組各觀察時間段pERK1/2表達無顯著差異?？侲RK1/2在各組各觀察時間段內表達穩(wěn)定無顯著變化。
　　 12.NF-κB激活:SA組N

19、F-κB活化單位p65少量表達且各時期無明顯變化。BLM造模后p65表達明顯增多且第14天達到高峰，第28天有所下降。E-ES和W-ES組各觀察時間段p65表達較BLM組明顯下降(P＜0.05);L-ES組和BLM組各觀察時間段p65表達尚無統(tǒng)計學差異（day28:P=0.139）。
　　 結論:
　　 本實驗通過大鼠氣管內注入博來霉素后成功建立肺纖維化動物模型，肺組織病理特點說明可用于肺間質纖維化的研究。早期開始應用內