無血清條件下黃腐酚通過活性氧爆發(fā)途徑誘導HL-60細胞發(fā)生急性死亡.pdf

1、背景：植物天然產(chǎn)物在抗腫瘤方面發(fā)揮著至關重要的作用。近年來，啤酒花提取物黃腐酚（Xanthohumol，XN）因其廣泛的生物學活性引起了人們的普遍關注。其中，自由基生物學相關的活性機制常常會得到較早的研究。作為黃酮類多酚化合物，XN的抗氧化活性自2000年開始首先得到了廣泛的研究和報道；但令人困惑的是，自2007年以來，XN的促氧化活性卻也陸續(xù)在多種細胞上獲得發(fā)現(xiàn)。我組前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，XN處理人急性髓系白血病細胞系HL-60細胞表現(xiàn)出

2、了較強的促氧化活性。但是，XN為什么會在細胞水平上屢屢表現(xiàn)出促氧化活性，個中原因卻仍未解決。因此，詳細解析XN在細胞水平上促氧化的具體情況，對XN促氧化活性本質的揭示就顯得尤為重要。
　　目的：解析XN促進HL-60細胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成的規(guī)律及其對細胞命運的影響，探索ROS生成機制研究細胞模型所需的合適條件，為進一步的ROS生成機制研究創(chuàng)造條件。
　　方法：由于普通細胞培養(yǎng)

3、過程中添加的血清對于ROS具有很強的清除活性，因此用于檢測ROS生成的實驗系統(tǒng)選擇為無血清體系。具體方法有：應用ROS熒光探針DCFH-DA、使用流式細胞術檢測細胞ROS產(chǎn)量，并通過對流式細胞術結果的點狀圖（dot plot）數(shù)據(jù)的分析，研究細胞碎片出現(xiàn)情況；通過乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase,LDH）釋放實驗檢測細胞破碎程度，并結合臺盼藍細胞計數(shù)檢測細胞數(shù)目的改變；應用活細胞成像系統(tǒng)觀察細胞形態(tài)的變化以及結合PI

4、熒光染色研究細胞膜通透性的改變；應用annexin V-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測細胞凋亡發(fā)生情況；應用酶聯(lián)免疫法檢測IL-1β的釋放；應用蛋白免疫印跡技術檢測凋亡、焦亡、程序性壞死等程序性細胞死亡方式的標記蛋白Caspase-3、GSDMD、MLKL的表達情況。
　　結果：研究發(fā)現(xiàn)（1）10μM XN能夠誘導HL-60細胞ROS的急劇爆發(fā)，但在更高濃度的XN作用下（20和40μM）檢測到的ROS水平卻急劇下降。流式數(shù)

5、據(jù)點狀圖分析發(fā)現(xiàn)，20和40μM XN處理造成了HL-60細胞出現(xiàn)大量碎片，提示發(fā)生了嚴重的細胞破碎現(xiàn)象。（2）LDH釋放實驗和臺盼藍計數(shù)實驗證實了細胞破碎、LDH釋放到培養(yǎng)液中、細胞數(shù)目下降這些現(xiàn)象的發(fā)生。同時，用抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸（NAC）進行干預，發(fā)現(xiàn)NAC能夠減弱LDH的釋放量，并使細胞數(shù)目的下降情況得到緩解。提示抗氧化劑NAC對XN導致的HL-60細胞破碎具有保護作用，細胞破碎與ROS的產(chǎn)生相關。（3）活細胞成像

6、觀察結果發(fā)現(xiàn)，XN處理導致HL-60細胞迅速膨脹、PI熒光染色結果顯示質膜通透性增加，NAC干預能有效緩解這些影響。提示細胞發(fā)生了ROS相關的膜通透性增加。（4）為了進一步解析該急性死亡的類型，檢測了細胞凋亡、細胞焦亡和程序性壞死這三種主要類型的細胞死亡。結果表明，這種急性細胞死亡并不屬于上述死亡方式。很可能就是因為ROS的大量爆發(fā)導致的細胞急性壞死。（5）最后，探討了研究ROS生成機制所需細胞模型的建立條件。實驗發(fā)現(xiàn)，10％血清的存在

7、可以完全掩蓋10μM和20μM XN誘導的ROS升高現(xiàn)象，細胞碎片也近乎消失；1%到10%不同濃度血清對10μM XN產(chǎn)生ROS影響的研究結果表明2%濃度的血清已能夠完全掩蓋ROS的生成?？梢?，在研究ROS生成的詳細機制時，實驗系統(tǒng)中要排除血清的存在；而針對無血清體系造成的細胞碎片增加的弊端，需要通過劑量依賴曲線，綜合考慮ROS產(chǎn)量和細胞碎片這一對矛盾，選擇ROS產(chǎn)量變化的拐點作為最適實驗濃度。例如，本實驗中的10μM。
　　結論