Toll樣受體4介導(dǎo)角膜棘阿米巴感染炎癥反應(yīng)及低氧對(duì)其的調(diào)控作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 棘阿米巴角膜炎(Acanthamoebakeratitis，AK)是棘阿米巴原蟲感染角膜引起的一種嚴(yán)重的致盲性眼病。近年來(lái)，隨著角膜接觸鏡的廣泛使用，其發(fā)病率迅速升高。AK的發(fā)病與角膜創(chuàng)傷、接觸污水源、配戴角膜接觸鏡明顯相關(guān)，其中配戴角膜接觸鏡是其最主要的危險(xiǎn)因素。研究報(bào)道，每百萬(wàn)個(gè)角膜接觸鏡配戴者中，AK的罹患者美國(guó)為1.36人，荷蘭為3.06人，英國(guó)為17.53-21.14人;在我國(guó)報(bào)道的第一例AK是由角膜

2、接觸鏡引起，并且與接觸鏡相關(guān)性AK，約占AK患者的30.8％。由于棘阿米巴包囊具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性、抗藥性并能長(zhǎng)期緩慢在角膜生長(zhǎng)，導(dǎo)致該病藥物治療效果差、術(shù)后易復(fù)發(fā)，使AK成為臨床上治療非常棘手、具有較高致盲率的角膜感染。因此，認(rèn)識(shí)角膜感染發(fā)病機(jī)制和揭示宿主抗棘阿米巴感染的免疫防御機(jī)制具有至關(guān)重要的意義。
　　 角膜上皮細(xì)胞是角膜抵抗病原體感染的第一道屏障，也是角膜天然免疫防御系統(tǒng)的主要組成細(xì)胞，有賴于其模式識(shí)別受體(patte

3、rnrecognitionreceptors，PRRs)對(duì)特定病原體的快速識(shí)別，通過(guò)產(chǎn)生豐富的炎性因子、炎性介質(zhì)及抗菌肽等激活防御系統(tǒng)，清除病原。Toll樣受體(Tolllikereceptors，TLRs)是一種重要的PRR，它通過(guò)識(shí)別許多病原微生物共有的特殊結(jié)構(gòu)-病原相關(guān)分子模式（pathogenassociatedmolecularpatterns，PAMPs），激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的生成和釋放，趨化炎性細(xì)胞

4、浸潤(rùn)，啟動(dòng)炎癥和免疫反應(yīng)，從而在防御細(xì)菌、真菌、病毒等病原體入侵中發(fā)揮重要作用。
　　 Toll樣受體4(TLR4)是人們最早發(fā)現(xiàn)的TLR，其主要表達(dá)于免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等，也可以表達(dá)宿主-環(huán)境接觸處的上皮細(xì)胞如呼吸道上皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞等。TLR4識(shí)別相應(yīng)配體后，可通過(guò)MyD88依賴途徑或MyD88非依賴途徑，激活下游信號(hào)通路，最后活化核轉(zhuǎn)錄因子(nuclearfactorkappa-light-chain-en

5、hancerofactivatedBcells，NF-κB)、干擾素調(diào)控因子-3（interferon-regulatedfactor-3，IRF-3）等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和啟動(dòng)先天免疫。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在人角膜上皮細(xì)胞中TLR4為陽(yáng)性表達(dá);應(yīng)用棘阿米巴原蟲刺激人角膜細(xì)胞檢測(cè)TLR1-10表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)TLR4顯著升高，說(shuō)明TLR4可能參與棘阿米巴角膜炎的炎癥反應(yīng)。
　　 眾所周知，氧是人

6、體新陳代謝和生命活動(dòng)的關(guān)鍵物質(zhì)，同時(shí)組織氧分壓的變化也是重要的環(huán)境信號(hào)，參與機(jī)體的許多生理和病理過(guò)程如炎癥、感染、缺氧等。角膜代謝所需要的氧80％來(lái)自外界空氣，接觸鏡附著于角膜表面，使角膜處于低氧環(huán)境，從而影響角膜上皮細(xì)胞的生物特性，如上皮細(xì)胞水腫、凋亡、壞死、脫落等，破壞上皮屏障功能，降低上皮細(xì)胞的天然防御功能。研究發(fā)現(xiàn)低氧可促進(jìn)綠膿桿菌對(duì)角膜上皮細(xì)胞的粘附、減少上皮細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞凋亡，增加角膜上皮細(xì)胞對(duì)綠膿桿菌的易感性。近年研究

7、發(fā)現(xiàn)低氧能夠調(diào)控TLR4基因的表達(dá)，但因細(xì)胞類型和低氧培養(yǎng)條件的不同，低氧對(duì)TLR4的調(diào)控作用有所差異，然而低氧對(duì)人角膜上皮細(xì)胞TLR4的調(diào)控研究，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。既然TLR4參與棘阿米巴角膜炎的炎癥過(guò)程，因此有必要對(duì)低氧是否調(diào)控人角膜上皮細(xì)胞TLR4及其信號(hào)通路、低氧是否通過(guò)調(diào)控TLR4而影響角膜上皮細(xì)胞對(duì)棘阿米巴的易感性進(jìn)行深入研究，這將為有效地預(yù)防角膜棘阿米巴感染提供新的思路。
　　 本研究分為兩個(gè)部分:一、應(yīng)用棘阿米

8、巴刺激人角膜上皮細(xì)胞，檢測(cè)TLR4基因與炎性因子白介素6(interleukin-6，IL-6)和IL-8分泌的變化，并應(yīng)用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)沉默TLR4基因的表達(dá)，檢測(cè)抑制TLR4后對(duì)炎性因子表達(dá)的影響，探討TLR4在人角膜上皮細(xì)胞對(duì)棘阿米巴刺激的天然免疫反應(yīng)中的作用。二、通過(guò)檢測(cè)低氧對(duì)棘阿米巴刺激角膜細(xì)胞誘導(dǎo)的TLR4基因，下游信號(hào)通路蛋白髓樣分化因子88(myeloiddifferentia

9、tionprimaryresponsegene88，MyD88)、NF-κB和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellularsignalregulatedproteinkinase1/2，ERK1/2)，以及炎性因子IL-8和干擾素-β（interferon-β，IFN-β）表達(dá)的影響，探討低氧是否通過(guò)調(diào)控人角膜上皮細(xì)胞TLR4及其信號(hào)通路，從而影響角膜棘阿米巴感染的炎癥反應(yīng)，分析低氧對(duì)棘阿米巴角膜炎易感性的影響，揭示角膜接觸鏡配

10、戴易患棘阿米巴角膜炎的原因，這將為棘阿米巴角膜炎的合理預(yù)防和治療策略提供理論依據(jù)。
　　 第一部分，Toll樣受體4介導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞對(duì)棘阿米巴的天然免疫反應(yīng)
　　 目的:
　　 研究Toll樣受體4在人角膜上皮細(xì)胞對(duì)棘阿米巴炎性反應(yīng)中的作用。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)永生化的人角膜上皮細(xì)胞(telomerase-immortalizedhumanepithelialcells，THCEs)和

11、棘阿米巴蟲株。先用不同濃度(1×103/ml、1×104/ml、1×105/ml、1×106/ml)的棘阿米巴刺激THCEs30min，孵育12h后收集細(xì)胞，RealTime-PCR檢測(cè)TLR4mRNA的表達(dá)，Westernblot檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)。用1×106/ml濃度棘阿米巴刺激THCEs，于刺激的不同時(shí)間點(diǎn)(1h、3h、6h、12h)收集的細(xì)胞分別采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-timequantitativepoly

12、merasechainreaction，Real-timePCR)和Westernblot檢測(cè)TLR4mRNA和蛋白表達(dá);收集的培養(yǎng)上清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-8水平。
　　 2.設(shè)計(jì)、合成特異性針對(duì)TLR4基因的小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)序列:正義鏈為5’-GGCAAUUCUUUC

13、CAGGAAATT-3’;反義鏈為5’-UUUCCUGGAAAGAAUUGCCAG-3’。陰性對(duì)照選擇與人類基因沒有任何同源的干擾序列，正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。采用脂質(zhì)體(Lipofectamine)2000介導(dǎo)TLR4-siRNA及陰性對(duì)照siRNA(NC-siRNA)轉(zhuǎn)染THCEs48h后，利用Real-timePCR和Weste

14、rnblot檢測(cè)TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)以評(píng)價(jià)抑制效果。利用棘阿米巴(1×106/ml)分別刺激轉(zhuǎn)染TLR4-siRNA及NC-siRNA的THCEs30min，孵育12h后利用ELISA檢測(cè)上清中細(xì)胞因子IL-6和IL-8的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.隨著棘阿米巴刺激濃度的增加，人角膜上皮細(xì)胞TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)逐漸升高;在1×106/ml的棘阿米巴刺激濃度下，人角膜上皮細(xì)胞TLR4mRNA和蛋白表達(dá)在

15、刺激后6h開始升高，并以時(shí)間依賴方式呈現(xiàn)上調(diào)。棘阿米巴刺激人角膜上皮細(xì)胞6h后，IL-6和IL-8的分泌明顯升高，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步上調(diào)。
　　 2.TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染人角膜上皮細(xì)胞后，TLR4mRNA及蛋白水平表達(dá)均受到顯著抑制。棘阿米巴刺激后TLR4-siRNA處理組IL-6和IL-8的分泌水平較NC-siRNA組顯著降低。
　　 結(jié)論:
　　 TLR4是人角膜上皮細(xì)胞識(shí)別棘阿米巴的重要受體并介導(dǎo)

16、炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-8的的表達(dá)，TLR4-siRNA可通過(guò)下調(diào)炎性因子的分泌達(dá)到抑制棘阿米巴角膜炎炎癥反應(yīng)的目的，為探索治療角膜棘阿米巴感染的新方法提供了理論依據(jù)。
　　 第二部分，低氧抑制Toll樣受體4介導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞對(duì)棘阿米巴的天然免疫反應(yīng)
　　 目的:
　　 研究低氧對(duì)TLR4介導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞對(duì)棘阿米巴炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)永生化人角膜上皮細(xì)胞(

17、THCEs)和棘阿米巴蟲株。THCEs分別置于常氧(21％O2)和低氧(1％O2)條件下37℃培養(yǎng)24h，設(shè)置空白對(duì)照組和棘阿米巴刺激組(1×106/ml)。采用AnnexinV-PE與7-AAD雙染法檢測(cè)細(xì)胞的生存活性。
　　 2.在常氧條件下，用棘阿米巴原蟲(1×106/ml)刺激已預(yù)先在低氧孵箱培養(yǎng)24h的THCEs30min后，再放入低氧孵箱孵育6h。收取的細(xì)胞利用Real-timePCR檢測(cè)TLR4、MyD88、IL-

18、8和IFN-βmRNA的表達(dá);利用Westernblot檢測(cè)TLR4、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）的蛋白表達(dá)。收取的上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)炎性細(xì)胞因子IL-8和IFN-β的分泌。
　　 3.在低氧條件下孵育THCEs，于不同的時(shí)間點(diǎn)(0h、6h、12h、24h、48h)收集細(xì)胞，分別采用Real-timePCR

19、和Westernblot檢測(cè)TLR4mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 4.將THCEs在低氧環(huán)境中孵育24h后，用TLR4的公認(rèn)配體脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）(1μg/ml)刺激6h。收取的細(xì)胞利用Real-timePCR檢測(cè)MyD88、IL-6、和IL-8mRNA的表達(dá);利用Westernblot檢測(cè)IκBα和p-IκBα的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞生存活性，

20、顯示低氧和棘阿米巴刺激對(duì)THCEs的生存活性均無(wú)顯著影響。
　　 2.Real-timePCR結(jié)果顯示，低氧可以下調(diào)棘阿米巴刺激THCEs引起的TLR4和通路分子MyD88的mRNA表達(dá);Westernblot結(jié)果顯示，低氧可以降低棘阿米巴刺激THCEs引起的TLR4、p-IκBα和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)，明顯升高IκBα的表達(dá);ELISA結(jié)果顯示，低氧可以抑制棘阿米巴誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-8和IFN-β的分泌。
　

21、　 3.Real-timePCR和Westernblot的結(jié)果顯示，低氧分別孵育THCEs24h和48h小時(shí)后，TLR4的mRNA和蛋白水平均明顯減低。
　　 4.LPS刺激試驗(yàn)結(jié)果顯示，低氧可以降低MyD88mRNA的表達(dá)，抑制IκBα的磷酸化，下調(diào)炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-8的分泌。
　　 結(jié)論:
　　 低氧通過(guò)抑制TLR4的表達(dá)及其信號(hào)通路的活化，從而抑制人角膜上皮細(xì)胞對(duì)棘阿米巴刺激引起的炎性反應(yīng)。低氧