海豚鏈球菌誘變發(fā)酵法制備透明質(zhì)酸及其在動物皮膚修復(fù)的應(yīng)用.pdf

1、目的：獲得透明質(zhì)酸高產(chǎn)的海豚鏈球菌突變株，并且透明質(zhì)酸的分子量及純度也要較高。將透明質(zhì)酸通過物理及化學方法制成凝膠，探究該類凝膠在動物皮膚修復(fù)中的潛在作用。
　　方法：首先對從羅非魚中分離的海豚鏈球菌進行16s rRNA的鑒定，確定為海豚鏈球菌后進行原始菌株的培養(yǎng)，主要在28℃，搖床培養(yǎng)，150 rpm。對菌體培養(yǎng)后 HA的提取方法為先加入等體積0.1％ SDS，再離心得上清，加入2倍體積酒精，4℃靜置過夜，再離心得沉淀，即為粗產(chǎn)

2、物，其可用于產(chǎn)物 HA含量的測定，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng) CTAB法純化后，用于紅外光譜的測定，與標準品比較，確定產(chǎn)物是否為透明質(zhì)酸。在上述培養(yǎng)條件下測定其生長曲線，取對數(shù)期的菌株進行紫外誘變，紫外線的功率為20W，照射距離為30cm，根據(jù)在不同時間下的菌體致死率，選擇照射時間為35s，該時間下菌體的死亡率在90%以上，未死亡的菌體理論上已經(jīng)產(chǎn)生突變。然后，篩選突變的菌體，經(jīng)培養(yǎng)，提取 HA，測定其 HA的含量、純度及分子量，并與未突變的菌體進行比

3、較，最后篩選留下 HA含量最高的菌株，該菌株在相同的紫外誘變條件下，進行第二次誘變，再篩選HA含量有所提高的菌株，最終留下 HA含量最高的菌株，原始菌株經(jīng)兩次紫外誘變后，其產(chǎn)量有明顯的提升。配制葡萄糖培養(yǎng)基與 BHI培養(yǎng)基不同比例混合的培養(yǎng)基，研究菌株在各比例培養(yǎng)基下的生長狀況。將 HA通過冷凍解凍的方法及加化學交聯(lián)劑的方法分別制成凝膠，記為 HAI和 HAII，應(yīng)用于兔子背部全層皮膚缺損的修復(fù)，觀察皮膚的修復(fù)情況，通過檢測動物體內(nèi)白細

4、胞的量，分析凝膠對動物的炎癥的影響。通過測量背部皮膚缺損的恢復(fù)情況，分析凝膠對傷口愈合的影響。
　　結(jié)果：得到了 HA高產(chǎn)的海豚鏈球菌，產(chǎn)量從(82.3±3.3) mg/L增加到(120±10.6) mg/L，增加了46.4%。經(jīng)提純后，蛋白質(zhì)含量從(0.178±0.011) mg/L降低到(0.032±0.017) mg/L，蛋白去除率為82.02%，純化的效率為88.32%。HA的分子量約為3×105Da，誘變前后變化不大。當

5、 BHI培養(yǎng)基與葡萄糖培養(yǎng)基的比例為7:3時，海豚鏈球菌的生長狀況比單獨在 BHI培養(yǎng)基中要好，差異具有顯著性，說明一定的葡萄糖培養(yǎng)基對菌的生長有利。兩種凝膠（HAI和 HAII）對皮膚傷口的愈合均有一定促進作用，并能減少傷口愈合后瘢痕的形成。在炎癥方面，兩種凝膠也有降低體內(nèi)炎癥及傷口處炎癥的作用。
　　結(jié)論：我們發(fā)現(xiàn)了一種新的有望作為透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌的鏈球菌——海豚鏈球菌 Streptococcus iniae，經(jīng)過紫外誘變后獲得