雷公藤對(duì)糖尿病肝臟損傷的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肝臟調(diào)節(jié)體內(nèi)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝，對(duì)于2型糖尿病的發(fā)生和進(jìn)展至關(guān)重要。糖尿病肝臟損傷主要表現(xiàn)為肝內(nèi)脂肪浸潤(rùn)導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝病，由于發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，因此并無(wú)特異性治療藥物或手段。肝臟是重要的天然免疫器官，也是炎癥介導(dǎo)的主要靶器官，免疫和炎癥在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中作用不容忽視。傳統(tǒng)中藥—雷公藤具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抑制免疫等藥理活性，雷公藤紅素是雷公藤的主要活性單體，其藥理活性顯著

2、而廣泛。目前為止，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)關(guān)于雷公藤制劑對(duì)糖尿病肝臟損傷的作用研究。本課題從動(dòng)物整體水平和細(xì)胞水平，評(píng)價(jià)雷公藤對(duì)糖尿病脂肪性肝臟損傷的作用，并應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性沉默致病基因，旨在進(jìn)一步探討雷公藤可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.體內(nèi)研究：Sprague-Dawley大鼠75只，雄性清潔級(jí)，隨機(jī)選取15只作為正常對(duì)照組（NC組，n=15）予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其余60只大鼠予高脂高糖飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后尾靜脈注射鏈脲佐

3、菌素30mg/kg誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型。成模大鼠隨機(jī)分為4組：糖尿病模型組（DM組）、雷公藤多苷低劑量干預(yù)組（DM+TL組，1mg/kgd）、雷公藤多苷中劑量干預(yù)組（DM+TM組，3mg/kgd）和雷公藤多苷高劑量干預(yù)組（DM+TH組，6mg/kgd）。干預(yù)8周后處死取材，檢測(cè)血糖、肝腎功能、血脂、血常規(guī)等生化指標(biāo)，測(cè)量大鼠體重（BW）、肝重（LW），計(jì)算肝指數(shù)；hematoxylin-eosin及Masson染色光學(xué)顯微鏡下觀察各組

4、大鼠肝組織病理形態(tài)的改變；ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清炎癥因子NF-κB，IL-1β和TNFα水平；應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、RT-PCR和Western Blotting技術(shù)觀察各組大鼠肝組織TLR4，MyD88，NF-κB，p-IκBα及下游炎癥因子IL-1β和TNFα基因和蛋白的表達(dá)。
　　2.體外研究：游離脂肪酸（FFAs，棕櫚酸：油酸=1:2）誘導(dǎo)人源肝癌細(xì)胞株（HepG2細(xì)胞）脂肪變性，油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況；應(yīng)用

5、CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生存率。體外化學(xué)合成TLR4 siRNA，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株，并篩選有效基因沉默序列。實(shí)驗(yàn)分為7組：正常對(duì)照組、FFAs組、FFAs+陰性空轉(zhuǎn)組、FFAs+TLR4 siRNA組、FFAs+雷公藤紅素組、FFAs+雷公藤紅素+陰性空轉(zhuǎn)組、FFAs+雷公藤紅素+TLR4 siRNA組。RT-PCR和Western Blotting技術(shù)從蛋白水平和基因水平檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞TLR4，MyD88，NF

6、-κB及下游炎癥因子IL-1β和TNFα表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.體內(nèi)研究：
　?。?）造模結(jié)果：高脂高糖喂養(yǎng)8周后大鼠血脂、胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR、胰島素分泌指數(shù)HOMA-β均較常規(guī)喂養(yǎng)組明顯升高（P＜0.05），說(shuō)明出現(xiàn)胰島素抵抗和高胰島素血癥；尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素后，高脂組大鼠血糖明顯升高，出現(xiàn)典型“三多一少”癥狀，提示2型糖尿病大鼠模型制備成功。
　?。?）一般指標(biāo)：
　　

7、①生化指標(biāo)：與NC組相比，DM組和雷公藤多苷不同劑量干預(yù)組大鼠血糖、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）均明顯升高（P＜0.05）；與DM組相比，雷公藤多苷不同劑量干預(yù)組大鼠血糖、TC和TG無(wú)明顯改變（P＞0.05）。各組大鼠間肝、腎功能和血常規(guī)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　②體重、肝指數(shù)（LW/BW）：與NC組相比，DM組和雷公藤多苷不同劑量干預(yù)組大鼠體重明顯降低（P＜0.05）；DM組和雷公藤多苷不同劑量干預(yù)組間大鼠體重

8、無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與NC組相比，DM組大鼠LW/BW明顯升高（P＜0.05），DM+TH組LW/BW低于DM組（P＜0.05），但仍高于NC組（P＜0.05）。
　　（3）雷公藤多苷對(duì)糖尿病大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響：光鏡下H&E染色顯示，NC組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞大小形態(tài)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；DM組肝小葉結(jié)構(gòu)輪廓大致消失，肝細(xì)胞排列紊亂，腫脹呈彌漫性大泡樣脂肪變性，匯管區(qū)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；雷公藤多苷干預(yù)組有

9、不同程度減輕，DM+TH組改善最明顯。Masson染色顯示，NC組大鼠無(wú)明顯纖維組織增生，DM大鼠可見(jiàn)門(mén)脈區(qū)少量纖維組織增生，雷公藤多苷各干預(yù)組有不同程度減輕。
　?。?）雷公藤多苷對(duì)糖尿病大鼠血清中炎性介質(zhì)水平的影響：與NC組相比， DM組大鼠血清NF-κB、IL-1β和TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）；與DM組相比，雷公藤多苷各干預(yù)組大鼠血清各因子水平有不同程度降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。
　?。?）雷公藤

10、多苷對(duì)糖尿病大鼠肝組織TLR4/MyD88/NF-κB免疫炎癥信號(hào)通路的影響：與NC組相比，DM組大鼠肝組織TLR4，MyD88，NF-κB，p-IκBα和下游炎癥因子 IL-1β，TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05）；與DM組相比，雷公藤多苷各干預(yù)組各因子mRNA和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性降低（P＜0.05）。
　　2.體外研究：
　?。?）最佳FFAs濃度篩選：HepG2細(xì)胞給予0.5mM FFAs呈現(xiàn)

11、明顯脂肪變性，且與正常對(duì)照組相比，不影響細(xì)胞活力（P＞0.05）。因此，確定0.5mM FFAs為最佳誘導(dǎo)濃度。
　?。?）最佳雷公藤紅素濃度篩選：脂肪變性的HepG2細(xì)胞給予0.5μM雷公藤紅素可見(jiàn)紅色脂滴顯著減少，與對(duì)照組相比，不影響細(xì)胞活力（P＞0.05）。因此，確定0.5μM雷公藤紅素為最佳干預(yù)濃度。
　?。?）熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA24小時(shí)后，熒光顯微鏡下細(xì)胞分布處胞漿均

12、可見(jiàn)綠色熒光，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到90％以上。說(shuō)明成功轉(zhuǎn)染干擾基因進(jìn)入HepG2細(xì)胞，并且達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效率。
　?。?）有效沉默序列的篩選：TLR4 siRNA序列3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48小時(shí)， TLR4基因和蛋白表達(dá)量最少，因此篩選TLR4 siRNA序列3為最有效沉默序列。
　　（5）雷公藤紅素對(duì)脂肪變性HepG2細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB免疫炎癥信號(hào)通路的影響：與NC組相比，F(xiàn)FAs組HepG2細(xì)胞

13、TLR4，MyD88，NF-B和下游炎癥因子IL-1β，TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)量都顯著增加（P＜0.05）；與FFAs組相比，TLR4 siRNA組和雷公藤紅素干預(yù)組各因子表達(dá)都顯著降低（P＜0.05）， TLR4 siRNA和雷公藤紅素聯(lián)合干預(yù)組表達(dá)進(jìn)一步降低（P＜0.05），NF-κB及下游炎癥因子抑制率低于TLR4。
　　結(jié)論：
　　雷公藤多苷能夠減輕糖尿病大鼠肝臟損傷，其機(jī)制可能與下調(diào)TLR4/MyD88/NF