雷公藤多苷對糖尿病大鼠腎組織纖維化影響及機制的研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（Diabetes mellitus，DM）患者最主要的微循環(huán)并發(fā)癥發(fā)生于腎臟的表現(xiàn)，主要累及腎小球，導(dǎo)致腎小球濾過率增高，蛋白濾過增加，出現(xiàn)大量蛋白尿，同時也是導(dǎo)致終末期腎?。‥nd stage renal disease, ESRD）的最主要原因。隨著DM患病人數(shù)的與日俱增，如何防止 DN發(fā)生及進展越來越獲得普遍關(guān)注。既往很多實驗發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷(

2、Tripterygium Wilfordii Polyglucosides, TWP)有較強的抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用，其作用特點是多部位，多靶點，既能作用于T細胞、樹突狀免疫細胞等，又可抑制炎癥因子、粘附因子、趨化因子等分泌，從而達到治療多種自身免疫性疾病的效果。近幾年大量基礎(chǔ)實驗證實，TWP可通過抗炎、免疫抑制作用減輕足細胞和基底膜受損程度，從而降低尿白蛋白排出，緩解腎小球硬化程度，延緩DN的發(fā)展過程，但 TWP對 DM大鼠腎臟纖維化及細

3、胞外基質(zhì)（ Extracellular matrix，ECM）沉積的作用機理尚不清楚。既往很多研究集中于 TGF-β1/Smad信號通路在心臟纖維化、肺纖維化及腎纖維化過程中的作用，但對TGF-β1/NF-κB信號通路對腎纖維化的作用機理尚未明確。因此，本研究以高糖高脂飲食聯(lián)合尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)行造模的DM大鼠為研究對象，采用ELISA方法、q-PCR方法、Western印跡方法及免疫組化方法，旨在研究TWP對TGF-β1/

4、NF-κB信號通路的影響，從而進一步明確TWP對DM大鼠腎組織纖維化的作用。
　　方法:
　　清潔級雄性SD大鼠70只，按照隨機數(shù)字表，隨機選取10只作為正常對照組（NC組，n=10）喂養(yǎng)常規(guī)飼料。其余60只大鼠高糖、高脂飼料喂養(yǎng)8周后予尾靜脈注射鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ，30mg/kg）建立2型糖尿?。═2DM）模型。將造模成功后的大鼠再隨機分為模型對照組（DM）、根據(jù)應(yīng)用TWP劑量的多少進一步分為低（

5、tripterygium glycosides，L-TWP，1mg/kg?d）、中（tripterygium glycosides，M-TWP，3mg/kg?d）、高（tripterygium glycosides， H-TWP，6mg/kg?d）劑量,每組各15只。造模成功后即開始灌胃， NC組和DM組以等量蒸餾水（2ml）灌胃，灌胃8周末處死取材。飼養(yǎng)動物期間按時記錄大鼠體重（BW）、血糖、24小時尿微量白蛋白（UMA）變化；處死大

6、鼠階段記錄 BW、腎重（KW）；留取血標本檢測血糖、肝腎功能、血脂及血常規(guī)；采用ELISA法檢測大鼠血清中TGF-β1、NF-κBp65、IV型膠原（Collagen IV，COL-IV）、纖連蛋白（Fibronection，F(xiàn)N）、層粘連蛋白（Laminin，LN）；留取腎組織標本，光鏡下觀察大鼠腎組織腎小球病理改變；采用q-PCR法、Western印跡法分別從基因水平、蛋白水平檢測大鼠腎組織中 TGF-β1、NF-κBp65、COL

7、-IV、FN、LN水平，采用免疫組化法檢測上述各因子蛋白表達的腎組織定位情況。
　　結(jié)果:
　　1.與NC組相比，高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，大鼠血甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、空腹胰島素（FINS）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和胰島β細胞功能指數(shù)（HOMA-β）高于NC組(P<0.05)；STZ注射后大鼠較NC組大鼠體重降低，同時伴有多飲、多尿、多食等癥狀表明T2DM大鼠造模成功。
　　2.一般指標：①體重、

8、血糖：與NC組相比，DM組大鼠造模后血糖顯著上升（P<0.05），體重顯著減輕（P<0.05）；②腎重指數(shù)（KW/BW）：與NC相比， DM組大鼠KW/BW明顯升高（P<0.05），TWP治療組中，KW/BW均有所下降（P<0.05），以H-TWP組下降最為顯著（P<0.05）；③血脂：與NC組相比，DM組大鼠TG、TC水平顯著升高（P<0.05），TWP治療組未見顯著改變（P>0.05）；④肝、腎功能、血常規(guī)：大鼠肝、腎功能和血常規(guī)在

9、各組間均無明顯差異（P>0.05）。
　　3.24h尿微量白蛋白（24h UMA）：①與NC組相比，DM組大鼠UMA水平顯著升高（P<0.05）；與DM組相比，TWP治療組大鼠UMA水平顯著降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。
　　4．各組大鼠腎小球病理形態(tài)學(xué)變化：NC組腎組織結(jié)構(gòu)正常；DM組HE染色可見腎組織內(nèi)大片炎性細胞浸潤，Masson染色可見腎組織出現(xiàn)明顯纖維化，PAS染色可見腎小球基底膜增厚。經(jīng)不同劑量TWP干預(yù)

10、后，上述病理改變明顯減輕，且呈劑量依賴性改善。
　　5.采用ELISA法檢測大鼠血清中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN水平：①與NC組相比，DM組血清TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN含量明顯增多（P<0.05）；與DM組相比，TWP治療組血清TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN含量顯著下降（P<0.05），且呈劑量依賴性下降。
　　6.應(yīng)用q-PCR法

11、檢測大鼠腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN mRNA的表達：①與NC組相比，DM組腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN mRNA表達水平顯著增多（P<0.05）；與DM組相比，TWP治療組腎組織中 TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN表達水平顯著降低（P<0.05），且呈劑量依賴性降低。
　　7.應(yīng)用Western印跡法檢測大鼠腎組織中TGF-β1

12、、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白的表達：①與NC組相比，DM組腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白表達顯著增多（P<0.05）；與DM組相比，TWP治療組腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白表達顯著下降（P<0.05），且呈劑量依賴性下降。
　　8.應(yīng)用免疫組化法檢測大鼠腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白的表達

13、：與NC組相比，DM組腎小球內(nèi)可見標記的TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN細胞浸潤（P<0.05）；TWP組可見腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN表達明顯降低（P<0.05），M-TWP組、H-TWP組較L-TWP組下降更加明顯（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1. TGF-β1介導(dǎo)腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過程，NF-κB炎性反應(yīng)信號通路所起的作用不容忽視。TWP干預(yù)組較

14、DM組大鼠KW/BW、24h UMA及病理改變均有所改善，且呈劑量依懶性。
　　2.雷公藤多苷具有獨特抗炎、免疫抑制作用，可抑制系膜細胞的增生，改善腎小球基底膜電荷狀態(tài)抑制蛋白排出，減輕腎小球纖維化。
　　3. TGF-β1及其活化的NF-κB炎性反應(yīng)信號通路共同介導(dǎo)ECM的合成，而且其又協(xié)同促進IV型膠原（COL-IV）、纖連蛋白（FN）及層粘連蛋白（LN）合成，共同介導(dǎo)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過程。
　　4. TWP