己酮可可堿和雷公藤多甙早期干預(yù)NOD小鼠糖尿病的研究.pdf

1、目的：1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，其主要病理生理改變是胰島B細(xì)胞受到T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)的破壞，致使胰島素分泌絕對(duì)不足。隨著病程的進(jìn)展，使病情難以控制，常出現(xiàn)酮癥酸中毒、大血管、微血管病變等各種糖尿病急性和慢性并發(fā)癥。近年來(lái)全球范圍內(nèi)1型糖尿病發(fā)病呈上升趨勢(shì)，已成為西方發(fā)達(dá)國(guó)家繼哮喘后的第二大兒童慢性疾病。在我國(guó)如將成人遲發(fā)性自身免疫性糖尿病(LADA)算在內(nèi)，1型糖尿病患者占全部糖尿病患者的10％左右。如何預(yù)防或免疫干預(yù)1型糖

2、尿病的發(fā)生發(fā)展是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。因此，本研究對(duì)NOD小鼠在發(fā)生糖尿病之前給予己酮可可堿(PTX)和雷公藤多甙(TWP)兩種藥物，觀察它們對(duì)1型糖尿病的干預(yù)效果，探察其可能的機(jī)制，為早期干預(yù)治療1型糖尿病尋找安全有效的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇7周齡雌性NOD小鼠99只，隨機(jī)分成三組，其中己酮可可堿組33只，雷公藤多甙組32只，對(duì)照組34只，在清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境，自由進(jìn)水進(jìn)食。8周齡時(shí)開始實(shí)驗(yàn)

3、，標(biāo)記編號(hào)、測(cè)體重。(2)給藥方法：己酮可可堿組給藥劑量為80mg／kg/次，給藥方法如下：第0-3天、13-16天，每日腹腔注射3次；第4-12天、17-26天，每日腹腔注射2次。雷公藤多甙組給藥劑量為5mg／kg／次，給藥方法如下：第0-3天、13-16天，每日腹腔注射2次；第4-12天、17-26天，每日腹腔注射1次。對(duì)照組同己酮可可堿組同法腹腔注射等量生理鹽水。三組均于實(shí)驗(yàn)的第1和第14天腹腔注射環(huán)磷酰胺(CP)1次，劑量為20

4、0mg／kg，以加速糖尿病發(fā)病。用藥后即開始每4天斷尾采血，用血糖儀測(cè)隨機(jī)血糖，如血糖連續(xù)2天=16mmol／L即診斷為糖尿病。小鼠在被確診糖尿病后或?qū)嶒?yàn)第28天結(jié)束時(shí)，測(cè)隨機(jī)血糖后斷頸處死。(3)檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡：取部分胰腺組織用Bouins液固定、石蠟包埋、切5μm厚切片。TUNEL法檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)。(4)胰島B細(xì)胞caspase-3、胰島素表達(dá)情況：石蠟切片脫蠟，免疫組化caspase-3、胰島素特異性染色觀察

5、caspase-3表達(dá)和胰島素分泌情況。(5)胰腺和脾臟caspase-8、Fas、FasLmRNA表達(dá)：另取部分胰腺和脾臟組織液氮冷凍后，Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，用基因特異性引物通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況，并用半定量法計(jì)算PCR產(chǎn)物灰度值。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)軟件完成，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間計(jì)數(shù)資料比較用X2檢驗(yàn)，組間計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)。 結(jié)果：(1)糖

6、尿病發(fā)病率：共有99只NOD小鼠進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)期間共有4只鼠死亡，被剔除。實(shí)際共有95只NOD小鼠，其中有49只發(fā)生糖尿病，對(duì)照組糖尿病發(fā)病率為69．70％(23／33)，而己酮可可堿組發(fā)病率僅為40．63％(13／32)，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0．05)。雷公藤多甙組發(fā)病率為43．33％(13／30)，與對(duì)照組相比差異亦有顯著性(P<0．05)。但己酮可可堿組和雷公藤多甙組比較無(wú)顯著差異(P>0．05見表3)。(2)胰島細(xì)

7、胞凋亡：己酮可可堿組凋亡指數(shù)為4．80_+0．60／100個(gè)胰島細(xì)胞，雷公藤多甙組凋亡指數(shù)為5．06+0．85／100個(gè)胰島細(xì)胞，而對(duì)照組為9．04_+1．02／100個(gè)胰島細(xì)胞，干預(yù)組與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0．01)，而干預(yù)組間相互比較無(wú)顯著差異(P>0．05)。(3)胰島caspase-3表達(dá)：己酮可可堿組發(fā)病小鼠胰島caspase-3顯色呈棕色、范圍小，雷公藤多甙組與己酮可可堿組相似。而對(duì)照組發(fā)病小鼠caspase-3顯色

8、呈深褐色、范圍廣，甚至在整個(gè)胰島均有顯色；對(duì)于未發(fā)病小鼠，干預(yù)組組僅見極少部分胰島細(xì)胞漿有少量散在分布的淡棕色，己酮可可堿組尤為明顯，而對(duì)照組胰島細(xì)胞漿中顯色相對(duì)深，且成片。高倍鏡下對(duì)每組小鼠胰腺切片進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)己酮可可堿組為22．67+_10．07／100胰島細(xì)胞，明顯少于對(duì)照組37．33+14．37／100胰島細(xì)胞(P<0．05)，而雷公藤多甙組caspase-3陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)為24．89+10．12／100胰島細(xì)胞，較對(duì)

9、照組亦明顯減少(P<0．05)。但是己酮可可堿組和雷公藤多甙組相比則未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。(4)胰島細(xì)胞胰島素表達(dá)：將各組分別進(jìn)行胰島素表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，己酮可可堿組為62．13+11．59／100細(xì)胞，雷公藤多甙組為57．25__+11．69／100細(xì)胞，兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。而對(duì)照組胰島素表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞為46．50+11．25／100細(xì)胞，與己酮可可堿組相比顯著減少(P<0．05)；與雷公藤多甙組相比雖未達(dá)到

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也下降了近10％。(5)胰腺caspase-8、Fas、FasLmRNA表達(dá)：對(duì)于發(fā)病小鼠，己酮可可堿組和雷公藤組較對(duì)照組caspase-8的條帶減弱；PTX組未發(fā)病小鼠未能檢測(cè)到caspase-8的表達(dá)條帶，而雷公藤多甙組和對(duì)照組未發(fā)病鼠可見到有較淡條帶。將干預(yù)組灰度值分別與相應(yīng)的β-actin灰度值相比(即半定量分析)，發(fā)現(xiàn)己酮可可堿組為0．81+0．10，雷公藤多甙組為0．84±0．11，而對(duì)照組為1．22+0．13

11、，干預(yù)組與對(duì)照組相比均有顯著差異(P<0．01)，而干預(yù)組間比較無(wú)顯著差異(P>O．05)。己酮可可堿組和雷公藤多甙組FasmRNA表達(dá)(分別為0．29_+0．08和0．30±0．11)較對(duì)照組(0．35+0．05)有下降，但未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>O．05)；己酮可可堿組FasLmRNA表達(dá)(0．90_+0．38)較對(duì)照組(1．33±0．17)明顯減弱(P

12、著下降(P<0．01)，與己酮可可堿組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>O．05)。(6)脾臟caspase-8、Fas、FasLmRNA表達(dá)：己酮可可堿組caspase-8半定量值為1．40±0．24，雷公藤多甙組1．24±0．22，而對(duì)照組僅為0．91±0．15，統(tǒng)計(jì)分析己酮可可堿組、雷公藤多甙組和對(duì)照組相比有顯著意義(前者P

13、0．09，兩組都顯著高于對(duì)照組(0．27±0．06，P0．05)。 結(jié)論：在NOD小鼠發(fā)生糖尿病之前分別給予己酮可可堿、雷公藤多甙干預(yù)