己酮可可堿和雷公藤多甙免疫干預(yù)NOD小鼠糖尿病的研究.pdf

1、目的：1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，其主要病理生理改變是胰島B細(xì)胞受到T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)的破壞，致使胰島素分泌絕對(duì)不足。隨著病情發(fā)展最終必須依賴(lài)胰島素治療，病程中常出現(xiàn)酮癥酸中毒、大血管、微血管病變等各種糖尿病急性和慢性并發(fā)癥。近年來(lái)全球范圍內(nèi)1型糖尿病發(fā)病呈上升趨勢(shì)，已成為西方發(fā)達(dá)國(guó)家繼哮喘后的第二大兒童慢性疾病。在我國(guó)如將成人遲發(fā)性自身免疫性糖尿病(LADA)算在內(nèi)，1型糖尿病患者占全部糖尿病患者的10％左右。如何預(yù)防或免疫

2、干預(yù)l型糖尿病的發(fā)生發(fā)展是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。因此，本課題在NOD小鼠發(fā)生糖尿病之前給予己酮可可堿(PTX)和雷公藤多甙(TwP)兩種藥物，觀察它們對(duì)1型糖尿病的干預(yù)效果。為早期干預(yù)治療1型糖尿病尋找安全有效的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇7周齡雌性NOD小鼠102只，隨機(jī)分成三組，其中對(duì)照組37只，己酮可可堿組33只，雷公藤多甙組32只，在清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境，自由進(jìn)水進(jìn)食。8周齡時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記編

3、號(hào)、測(cè)體重。(2)給藥方法：己酮可可堿組給藥方法如下：80mg／kg／次，第O一3天、13—16天，每日腹腔注射3次；第4—12天、17—26天，每日腹腔注射2次。雷公藤多甙組給藥方法如下：5mg／kg／次，第0—3天、13一16天，每日腹腔注射2次；第4—12天、17—26天，每日腹腔注射1次。對(duì)照組同己酮可可堿法腹腔注射等量生理鹽水。三組均于實(shí)驗(yàn)的第l和第14天腹腔注射環(huán)磷酰胺(CP200mg／kg)1次，加速糖尿病發(fā)病。用藥后即開(kāi)

4、始每4天斷尾采血用血糖儀測(cè)隨機(jī)血糖，如血糖連續(xù)2天≥16mmol／L即診斷為糖尿病。小鼠在被確診糖尿病后或?qū)嶒?yàn)第28天結(jié)束，測(cè)隨機(jī)血糖后斷頸處死。(3)組織病理學(xué)檢查：取部分胰腺組織用Bouins’液固定、石蠟包埋、切5um厚度切片。HE染色，光鏡下進(jìn)行胰島炎評(píng)分。免疫組化胰島素特異性染色觀察胰島素分泌情況。(4)細(xì)胞因子基因表達(dá)檢測(cè)：另取部分胰腺組織液氮冷凍后，Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，用基因特異性引物通過(guò)RT—PCR方

5、法檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況，并用半定量法計(jì)算PCR產(chǎn)物灰度值。(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)量參數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間計(jì)量參數(shù)的差異用t檢驗(yàn)或方差分析進(jìn)行比較，組間變量比較用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，組間頻率比較用x2檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)均用SPSSlO．O統(tǒng)計(jì)軟件完成。 結(jié)果：共有102只NOD小鼠進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)期間共有5只鼠死亡，被剔除。實(shí)際共有97只NOD小鼠完成實(shí)驗(yàn)，有51只發(fā)生糖尿病，其中對(duì)照組糖尿病發(fā)病率為7L43％(25／35)，

6、而己酮可可堿組發(fā)病率為40．63％(13／32)，雷公藤多甙組發(fā)病率為43．33％(13／30)，己酮可可堿組和雷公藤多甙組與對(duì)照組相比差異均有顯著性(PO．05)。 各組初始血糖均值己酮可可堿組6．42±0．50mmol／L，雷公藤多甙組6．56±1．05mmol／L，對(duì)照組6．66±0．44mmol／L無(wú)顯著差異。各組血糖均值的變化在治療開(kāi)始后

7、的1-18天內(nèi)都十分相近(P>O．05)；但在18天以后開(kāi)始出現(xiàn)差異。將各組血糖實(shí)測(cè)值分別進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬，可見(jiàn)到雖然各組的血糖均值在總體上均呈上升趨勢(shì)，但對(duì)照組的血糖均值上升速度最快(一元趨勢(shì)線斜率最大)，其次是己酮可可堿組和雷公藤多甙組，己酮可可堿組和雷公藤多甙組的血糖均值的變化趨勢(shì)較為接近。 組織學(xué)觀察結(jié)果顯示：己酮可可堿組多數(shù)胰島結(jié)構(gòu)保持完整，淋巴細(xì)胞主要在胰島周邊浸潤(rùn)，胰島細(xì)胞清晰可見(jiàn)，少數(shù)胰島炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，胰島炎評(píng)分

8、均值與對(duì)照組差異呈顯著性(L02±0．98，P

9、堿組，兩組相比胰島炎評(píng)分均值存在顯著差異(P

10、組和雷公藤多甙組TNF—αmRNA和IFN-YmRNA的表達(dá)下調(diào)，用半定量方法進(jìn)行分析，顯示己酮可可堿組TNF—QmRNA灰度值為O．46±0．32、IFN—γmRNA灰度值為0．65±0．10，于對(duì)照組相比差異顯著(P